犬蝠源呼肠病毒的分离与鉴定

摘要

[目的]从野生蝙蝠体内分离病毒,为开展蝙蝠的病原监测奠定基础.[方法]从广东省韶关采集了30份野生犬蝠样品,研磨后接种Vero E6细胞,从中分离到2株病毒,对其中一株病毒进行研究,使用生物学与分子生物学方法确定其分类学地位.[结果]该毒株在Vero E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变,表现为细胞内颗粒增多,细胞收缩、变圆,最后细胞从瓶壁脱落.反复冻融3次后,收集细胞及培养液,电镜观察发现,病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,呈正二十面体对称,将病毒命名为Bat/China/2003(B/03).红细胞凝集试验表明该病毒能凝集健康人O型血红细胞,不能凝集SPF鸡、实验用普通级牛、大鼠和豚鼠的红细胞.理化特性试验表明该病毒对氯仿有抵抗力、能耐受pH3.0的酸性环境、50℃水浴1 h病毒丧失感染能力、1 mol·L-1MgC12能提高病毒对热的抵抗力.病毒基因组经琼脂糖凝胶电泳分大、中、小3个区段.用哺乳动物呼肠病毒特异性引物进行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增得到了预期大小的片段.测序结果经NCBI BLAST分析表明,与呼肠病毒科正呼肠病毒属的Ndelle virus核苷酸同源性最高为91.2%.用DNAMAN Multiple Alignment进行序列同源性分析,与哺乳动物呼肠病毒血清1、2、3型的代表株T1L,T2J,T3D的核苷酸同源性分别为89.9%、76.9%、89.9%.[结论]由以上结果推断该病毒为呼肠病毒科的成员.