犬蝠源呼肠孤病毒的分离鉴定及其生物学特性的研究

摘要

本文将30份广东省韶关市送检的野生犬蝠样品，研磨后接种Vero-E6细胞，从中分离到2株病毒。其中一株在Vero-E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变，表现为细胞内颗粒增多，细胞收缩、变圆，最后细胞从瓶壁脱落。反复冻融3次后，收集细胞及培养液，电镜观察发现，病毒粒子无囊膜，有双层衣壳，呈正二十面体对称，将病毒命名为Bat/China/2003(B/03)。红细胞凝集试验表明该病毒能凝集健康人O型血红细胞，不能凝集SPF鸡、实验用普通级牛、大鼠和豚鼠的红细胞。理化特性试验表明该病毒对氯仿有抵抗力；能耐受pH3.0的酸性环境；50℃水浴1h病毒丧失感染能力；1MMgcl2能提高病毒对热的抵抗力，增强病毒的活性。病毒基因组经琼脂糖凝胶电泳分大、中、小3个区段。用哺乳动物呼肠孤病毒(mammalianorthoreovirus，MRV)特异性引物进行反转录-聚合酶链式反应(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)，扩增得到了预期大小的片段。测序结果经NCBIBLAST分析表明，与呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属的Ndellevirus(NDEV)核苷酸同源性最高为91.2％。用DNAMANMultipleAlignment进行序列同源性分析，与MRV血清1、2、3型的代表株T1L、T2J、T3D的核苷酸同源性分别为89.9％、76.9％、89.9％。以上结果证明该病毒为呼肠孤病毒科的成员。 采用RT-PCR方法，测定犬蝠源呼肠孤病毒B/03株全基因组10个基因节段完整ORF序列。使用分子生物学软件对其核苷酸和氨基酸序列进行同源性分析，绘制系统发生进化树，并分析各基因编码产物的功能区与结构域，从而预测各蛋白的功能。根据B/03株编码的蛋白和呼肠孤病毒科其它成员编码蛋白的比较结果推测，B/03株的L1、L2、L3、M1、M2、S1、S2、S4基因分别编码病毒的结构蛋白λ3、λ2、λ1、μ2、μ1、σ1、σ2、σ3，而M3、S1、S3基因编码病毒的非结构蛋白μNS、σ1S、σNS(S1基因编码两种蛋白，结构蛋白σ1和非结构蛋白σ1S)。 对功能性结构域的分析表明，λ3蛋白氨基酸序列中含有RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRp)的保守区，推测是病毒的RdRp。λ2蛋白有鸟苷转移酶和甲基化酶的活性区，推测可能在病毒复制时mRNA的帽化过程中起作用。λ1蛋白的N-末端发现了锌指结构和RNA螺旋酶的保守区，推测λ1蛋白具有dsRNA连接活性和ATPase活性。μ2蛋白含有两个NTP-binding基序，这表明它可能具有核苷三磷酸酶活性。μ1蛋白的C-末端有4个大的亲水区，都位于蛋白的表面，可能形成环和折叠，而且抗原性较高，推测有可能引起宿主细胞的免疫反应。σ1蛋白的N-末端有一个连续的能形成alpha-helicalcoiledcoils结构的七肽重复序列(a-b-c-d-e-f-g)n，该区域可能与病毒的血凝活性有关。同时还发现，σ1蛋白有4个潜在的糖基化位点，推测σ1蛋白可能是糖基化的蛋白，与病毒的吸附有关。σ2蛋白的C-末端有一个双亲性的α-螺旋，它与大肠杆菌的DNA依赖性RNA聚合酶的β亚基非常相似，推测具有dsRNA连接活性。σ3蛋白的N-末端有锌指结构域，C-末端有dsRNA连接区。μNS蛋白的C-末端发现了七肽重复序列能形成alpha-helicalcoiledcoils结构，推测这种结构有利于该蛋白与细胞骨架的连接。在μNS蛋白的N-末端还发现了ATPase的保守区，预示其可能具有ATPase活性。σ1S蛋白富含碱性氨基酸和α-螺旋，有一个潜在的糖基化位点，但其功能尚不清楚。σNS蛋白富含Cys残基和α-螺旋，推测可能具有ssRNA连接活性。 犬蝠源呼肠孤病毒B/03株L1基因编码的RdRp与呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属的RdRp同源性较高(91.9％～98.2％)，由此推测B/03株属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属。B/03株各基因编码的蛋白与正呼肠孤病毒属的其他成员进行同源性分析的结果表明，B/03株与MRV氨基酸同源性最高，系统发生进化树也表明B/03株的各基因与MRV属于同一个群。与已报道的从蝙蝠体内分离的正呼肠孤病毒不在同一群。由此可以初步推断，犬蝠源呼肠孤病毒B/03株属呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属，哺乳动物正呼肠孤病毒。S1基因编码病毒的型特异性抗原，系统发生进化树表明，B/03株的S1基因与MRV血清1型的进化关系最近。但仅据此推断B/03株的血清型尚不足够，还有待于进一步的研究。 犬蝠源呼肠孤病毒B/03株各基因的序列比较结果表明，B/03株各基因节段与不同呼肠孤病毒毒株同源性相近，由此推测该毒株可能是在自然感染过程中经长期的重配形成的。

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第一章绪论

第二章犬蝠源呼肠孤病毒的分离鉴定

第三章犬蝠源呼肠孤病毒全基因组序列的测定与分析

3.1材料与方法

3.2结果

3.2.1 L1基因

3.2.2 L2基因

3.2.3 L3基因

3.2.4 M1基因

3.2.5 M2基因

3.2.6 M3基因

3.2.7 S1基因

3.2.8 S2基因

3.2.9 S3基因

3.2.10 S4基因

3.2.11小结

3.3讨论

第四章结论

参考文献

致谢

作者简历