胡桃楸ISSR-PCR反应体系的建立及优化

摘要

在研究胡桃楸遗传多样性的过程中,为了获得清晰、重复性好的ISSR扩增结果,采用改良的CTAB法提取胡桃楸基因组DNA,利用正交设计与单因子试验相结合的方法对影响胡桃楸ISSR-PCR反应体系的5个主要因素(Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA)在4个水平上进行优化设计.通过综合比较分析,筛选出各反应因素的最佳水平,建立胡桃楸ISSR-PCR最佳反应体系:20μL的反应体系中,Taq酶1.0 U,Mg2+2.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,模板DNA 50～250 ng,引物0.4μmol/L.在此基础上筛选出13条多态性好、扩增稳定的ISSR引物,并确立了最佳退火温度和循环次数.这一优化系统的建立为今后利用ISSR技术进行胡桃楸遗传多样性、亲缘关系以及物种保护等的研究奠定了基础.