带有雌激素受体编码区的KLF4表达载体的构建及其转染后对细胞的可调控表达

摘要

目的 构建KLF4-ER基因表达的带有加强型绿色荧光蛋白(EGFP)的博来霉素抗性的pCGF5 IEGZ载体,利用其对小鼠巨噬细胞系RAW264.7进行稳定转染株的筛选并鉴定.方法 以pEGFP-KLF4质粒为模板,设计带有酶切位点的KLF4上下游引物,以PCR扩增获得编码序列,其产物电泳鉴定后纯化回收,并将改良型小鼠雌激素受体的激素链接区序列与之融合,KLF4-ER片段纯化回收后插入pCGF5-IEGZ载体中;重组体转化细菌,筛选扩增后酶切鉴定;重组质粒转染细胞,倒置荧光显微镜观察EGFP的表达,使用zeocin筛选稳定株,流式细胞术检测转染率;Western Blot、RT-PCR检测转染后的KLF4表达;经Tamoxifen诱导后,DAPI核染色观察重组载体转运胞核中的表达以及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测目的基因表达的效应.结果 电泳鉴定KLF4全长片段及pCGF5 IEGZ-KLF4ER重组体双酶切结果 符合设定要求,重组质粒构建成功;目的载体成功转入细胞中,转染19 d后流式细胞测定稳定株转染效率达95.31%;20 d KLF4蛋白及mRNA水平均明显高于空转组和阴性组(P<0.01).Tamoxifen诱导靶基因的表达生物效应优于对照组.结论 该实验成功地用pCGF5 IEGZ型载体将带有可受调控的雌激素受体编码区的目的基因导入通用的小鼠巨噬细胞系中,为今后研究靶基因在破骨细胞中可诱导性过表达提供了新的途径.