川牛膝MSAP反应体系的优化及引物筛选

摘要

目的:首次对川产道地药材川牛膝表观遗传多样性进行研究,建立并优化川牛膝甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)最佳反应体系。方法:以川牛膝苗期叶片为材料,利用正交试验设计对川牛膝MSAP反应体系中预扩增和选择性扩增中关键影响因素进行考察,建立川牛膝MSAP反应最佳体系。结果:川牛膝MSAP最佳反应体系为:酶切体系(20μL),300 ng DNA、1.5μL Eco RI、1.5μL Hpa II或1.5μL Msp I(Hpa II);连接体系(25μL):15μL酶切产物、1μL Eco RI adaptor、1μL Hpa II/Msp I adaptor、0.2μL T4连接酶;预扩增体系(25μL):连接产物1μL、r Taq酶1 U、引物分别1.5μL、d NTP 2μL;选择性扩增体系(25μL):预扩产物稀释50倍、r Taq酶1 U、引物1.5μL、d NTP 3μL,并运用优化后的体系,最终从川牛膝MSAP的256对引物中筛选出有效引物6对。结论:优化后的体系保证了稳定的图谱、清晰的条带,筛选出的6对引物组合特异性好,能够用于后续川牛膝DNA甲基化相关实验研究,同时,为其他药用植物MSAP分析提供了参考。