视网膜母细胞瘤发生发展的关键基因挖掘及验证

摘要

目的探索与视网膜母细胞瘤(RB)发生发展相关的关键基因。方法从GEO数据库中下载3个RB基因表达谱芯片数据集,合并后用R软件sva包消除批次效应、limma包分析RB的差异表达基因(DEGs)、clusterProfiler包对DEGs进行GO富集和KEGG通路分析,采用STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白相互作用(PPI)网络并利用cytoHubba寻找网络核心基因;对加权基因共表达网络(WGCNA)进行分析,将基因划分模块与临床信息进行关联以找到关键模块,进一步寻找关键模块中的关键基因。体外培养Y79、WERI-RB-1和ARPE-19细胞,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测5个关键基因的mRNA表达量;收集20例RB组织样本,利用免疫组化技术检测关键蛋白的表达情况。结果共得到1254个DEGs,其中表达上调基因422个,表达下调基因832个。GO富集分析结果显示,DEGs主要与蛋白质异二聚体活性、阳离子跨膜转运蛋白活性、染色质结合等生物学功能相关;KEGG通路分析结果显示,DEGs主要富集在细胞周期、光传导、DNA复制等通路。共得到79个位于PPI网络中的核心基因。WGCNA分析将DEGS划分为11个共表达基因模块,根据各个模块与临床性状之间的Pearson相关系数筛选出blue、pink、turquoise、red和brown共5个重要模块,其中blue模块与诊断年龄的相关系数最高(r=0.65),综合分析后得到染色体结构维持蛋白4(smc4)、微小染色体维持蛋白6(mcm6)、着丝粒蛋白K(cenpk)、驱动蛋白家族成员15(kif15)、胞质分裂蛋白调控因子-1(prc1)等5个关键基因。qRT-PCR验证结果表明,prc1、cenpk基因在Y79、WERI-RB-1细胞中的相对表达量明显高于ARPE-19细胞(P<0.05);免疫组化检测结果显示,PRC1蛋白在RB组织样本中的表达量明显高于正常视网膜组织(P<0.05)。结论与RB发生相关的关键基因包括smc4、mcm6、cenpk、kif15、prc1等;PRC1蛋白在RB中表达量增高,可能对RB的发生发展具有重要影响。