胰高血糖素样肽-1类似物利拉鲁肽对高糖环境下人脐静脉内皮细胞自噬的影响

摘要

目的 探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物利拉鲁肽(LIRA)对高糖环境下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬的影响及其可能机制.方法 研究分3部分进行:(1)取体外培养的HUVECs作为研究对象,设对照组(A组)和高糖组(B组),分别用5.5mmol/L、25mmol/L的正常及高糖培养基培养,培养时间为12、24和48h.RT-PCR测定细胞内自噬相关基因beclin-1、LC3、p62 mRNA的表达,选出高糖对自噬影响的最佳培养时间点;(2)以HUVECs作为研究对象,予以低、中、高剂量(10、50、100nmol/L)的LIRA进行干预(C1、C2、C3组),按第一部分实验得出的最佳时间点培养细胞后,采用同样的方法检测上述指标,得出最适宜的LIRA干预浓度;(3)分别在最佳剂量LIRA干预高糖组(C组)和单纯高糖组(B组)的基础上,加入AMPK抑制剂ComC(10μmol/L)处理(D组和E组),以激光共聚焦荧光显微镜观察LC3与绿色荧光蛋白(GFP)融合(GFP-LC3)的荧光斑点来监测自噬体的形成,Western blotting检测细胞内自噬标志物beclin-1、p62蛋白的表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR比值的变化.结果 (1)与A组相比,不同培养时间下B组beclin-1、LC3 mRNA表达减少,而p62 mRNA表达增加(P<0.05),且24h时这种变化最为显著,故选择24h作为最佳培养时间;(2)与B组相比,C3组beclin-1、LC3 mRNA表达增加,p62 mRNA表达减少(P<0.05),且C1、C2、C3组LC3 mRNA表达上升(P<0.05),呈剂量依赖性,故将100nmol/L作为LIRA的最佳干预浓度;(3)与B组相比,C组的beclin-1蛋白、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-AMPK/AMPK升高,p62蛋白、p-mTOR/mTOR降低(P<0.05).D组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-AMPK/AMPK比值低于C组,p-mTOR/mTOR比值高于C组(P<0.05),而beclin-1、p62表达与C组比较差异无统计学意义(P>0.05).与D组比较,E组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低,p62蛋白表达增多(P<0.05).免疫荧光检测显示GFP-LC3自噬荧光点数量变化的趋势与蛋白水平变化趋势一致.结论 GLP-1类似物LIRA可能通过磷酸化激活AMPK/mTOR介导的信号通路,激活自噬的发生,对高糖培养的HUVECs产生保护作用.