盘基网柄菌DJ-1蛋白的原核表达及抗体制备

摘要

盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)是研究神经退行性病变的模式生物,可用以研究帕金森病相关基因DJ-1的作用和致病机理.本研究设计特异性引物扩增了人类DJ-1的盘基网柄菌同源基因片段DAM,并利用酶切位点BamH Ⅰ和Hind Ⅲ将DAM插入质粒载体pQE-30产生重组载体pPROF696,序列测定后对DJ-1进行了生物信息学分析.同时,通过电穿孔法将pPROF696转入大肠杆菌M15,并利用IPTG诱导DJ-1蛋白表达.经SDS-PAGE分析、Western-blot印迹和His标签树脂对DJ-1粗蛋白纯化后进行抗体制备,并在大肠杆菌M15转化株和盘基网柄菌转化株与野生型内对抗体进行检验.结果表明:本研究成功构建了盘基网柄菌DJ-1的原核表达载体pPROF696,所制备的盘基网柄菌DJ-1多克隆抗体能成功检测大肠杆菌M15和盘基网柄菌野生型与转化株中的DJ-1蛋白.这为今后检测盘基网柄菌细胞内DJ-1的表达水平,建立其与盘基网柄菌表现型相关性,标记DJ-1的亚细胞定位和进一步研究DJ-1在帕金森病中的作用机理奠定了基础.