Arg188Gln(G/A)突变对犬尿氨酸酶活性的影响

摘要

目的:验证犬尿氨酸酶(KYNU)Arg188Gln(G/A)突变能否改变KYNU的活性。方法:抽提人肝脏细胞的总RNA,通过RT-PCR法获得KYNU基因全长cDNA,以KYNU基因Arg188Gln位点附近序列为模板设计定点突变引物,完成Arg188Gln(G/A)的定点突变,将突变型和野生型KYNU基因克隆到pcDNA载体质粒中,获得野生型和突变型pcDNA-KYNU重组表达质粒,经酶切鉴定和测序验证后转染HEK293细胞,蛋白质印迹法检测KYNU在细胞中的表达,用高效液相色谱法检测HEK293细胞的KYNU活性。结果:野生型和突变型pcDNA-KYNU重组质粒在HEK293细胞中均能表达有活性的KYNU,KYNU的米氏常数分别为(9.833±0.513)μmol/L和(29.900±0.265)μmol/L,最大酶促反应速率分别为(0·700±0.096)nmol·mg^(-1)·min^(-1)和(0.084±0.003)nmol·mg^(-1)·min^(-1),差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:Arg188Gln(G/A)突变可以减弱KYNU的活性。