可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白的原核表达、鉴定与纯化及其对皮质神经元的跨膜转导

摘要

【目的】构建含蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)与脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)融合基因的表达质粒,原核表达可溶性TATPTD-Ngb,并鉴定、纯化,检测TATPTD-Ngb对皮质神经元的跨膜转导功能。【方法】提取SD大鼠脑组织总RNA,通过RT-PCR法构建编码TATPTD-Ngb的融合基因,克隆入pET28b原核表达载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析及可溶性鉴定,利用所表达的目的蛋白上的6个组蛋白用Ni-NTA琼脂进行亲和层析纯化,将不同浓度纯化的融合蛋白与原代培养皮质神经元共孵育2h,用Western-blot分析融合蛋白的跨膜转导。【结果】成功构建了含有TATPTD-Ngb的原核表达载体,插入片段500bp,成功表达并纯化了可溶性TATPTD-Ngb融合蛋白,相对分子质量约为20k,Westernblot鉴定显示表达蛋白具有抗原性,并具有转导入原代培养皮质神经元的功能,随给予蛋白浓度的增高进入神经元内的融合蛋白量增高。【结论】可溶性融合蛋白TATPTD-Ngb可转导入皮质神经元,对进一步研究Ngb的功能及蛋白转导技术的应用奠定了基础。