镁离子激活自噬促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的体外实验观察

摘要

目的:探讨镁离子对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)成骨分化的影响及其相关的机制.方法:以成骨诱导培养液(含镁离子0.8 mmol/L)为对照组,在此培养液中依次添加100、200、400μmol/L镁离子作为实验组(Mg 100、200、400μmol/L组).培养大鼠BMSCs,应用MTT法检测镁离子对细胞代谢活性的影响,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和对-硝基苯磷酸盐法检测细胞ALP蛋白的表达,茜素红染色和半定量分析检测细胞外基质钙盐的沉积情况,实时荧光定量分析检测ALP、骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥素(osteopontin,OPN)、BMP-2及镁转运蛋白1(MagT1)基因的相对表达量,激光共聚焦观察OCN、LC3蛋白的表达水平,Western Blot检测OCN蛋白、自噬相关蛋白的表达水平,自噬双标腺病毒转染观察细胞自噬流情况,荧光素酶法检测细胞内ATP浓度.结果:1、4、7 d时,实验组Mg 100、200、400μmol/L对大鼠BMSCs的增殖活性无显著影响(P>0.05);实验组Mg 100、200、400μmol/L ALP染色和茜素红染色较对照组深染,ALP蛋白分泌和ARS基质矿化均较对照组增加,其中Mg 100μmol/L组较对照组有显著性差异(P<0.01);7 d时,实验组Mg 100、200、400μmol/L的ALP、OCN、OPN、BMP-2和MagT1基因相对表达均较对照组上调,其中Mg 200μmol/L组表达量最高(P<0.01);4 d时,实验组Mg 100、200、400μmol/L OCN蛋白免疫荧光染色较对照组均有一定程度增强,其中Mg 200μmol/L组OCN蛋白荧光染色最强;Mg 200μmol/L组LC3蛋白荧光染色增强,呈斑点状分布;4 d时,实验组Mg 100、200、400μmol/L OCN和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达提高,Mg 200μmol/L组的蛋白条带染色最深、灰度值比最高.1 d时,AdPlus-mCherry-GFP-LC3B转染后Mg 200μmol/L组双荧光共表达成斑点状分布;3、6 d时,实验组Mg 100、200、400μmol/L细胞内ATP浓度较对照组均下降,且差异具有统计学意义(P<0.01),其中Mg 400μmol/L组的细胞内ATP水平最低.结论:生理范围内镁离子浓度增加对BMSCs增殖活性无显著影响,可以提高BMSCs成骨分化、矿化性能,其作用可能与MagT1的表达上调、细胞内ATP水平下降和自噬激活相关.