靶向线粒体绿色荧光蛋白表达载体的构建及初步应用

摘要

目的：构建靶向线粒体绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体，观测其在蛋白质细胞内定位中的应用价值。方法：化学合成细胞色素C氧化酶8A亚单位信号肽编码序列，克隆该序列到载体pEGFP-N1多克隆区Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ位点得到质粒pMito-EGFP，经测序鉴定后，用线粒体探针mitotracker染色已转染该载体的Hela细胞，荧光显微镜检测EGFP的细胞定位。以EPEC/EspF和EPEC/EspFL16E感染经pMito-EGFP转染的Hela细胞，免疫细胞化学法和荧光显微镜法观测野生型EspF和突变型EspFL16E的分布。结果：测序表明融合表达载体构建成功，荧光显微镜及图像分析表明该载体表达的EGFP和mitotracker共同定位于细胞线粒体；用其作为探针发现：野生型EspF定位于细胞线粒体，而突变型EspFL16E定位于胞浆中。结论：pMito-EGFP可作为线粒体的分子探针对靶向线粒体的蛋白进行亚细胞定位。