增强型绿色荧光蛋白腺病毒表达载体构建及其在移植干细胞示踪和定量中的初步应用

摘要

目的:构建增强型绿色荧光蛋白腺病毒表达载体,并观察其在移植真皮多能干细胞示踪和定量中的应用。方法:实验于2004-08/2005-10在解放军第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所完成。①细菌内同源重组构建含增强型绿色荧光蛋白基因的骨架质粒,PacⅠ酶切后转染293细胞,包装出增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体。增强型绿色荧光蛋白腺病毒表达载体鉴定正确后,收集293细胞反复冻融离心收集上清,粗制病毒液感染293细胞,扩增重组病毒载体。②选取新生1d雄性大鼠1只作为供体,剪取皮肤进行真皮多能干细胞的分离培养鉴定。将第7代粗制病毒液加入生长状态良好的真皮多能干细胞,转染后5d观察绿色荧光蛋白阳性细胞数量,计数绿色荧光蛋白阳性细胞百分比。③选取60只成年Wistar大鼠作为受体,随机分为全身照射组和正常对照组,各30只。全身照射组大鼠接受总剂量为5Gy的γ射线照射,正常对照组不接受放射。两组大鼠均接受尾静脉移植的1mL增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体转染的真皮多能干细胞悬液。两组分别于照射后5d,1,2,3,4周荧光显微镜下观察真皮多能干细胞在骨髓组织中的分布情况,每个时相点6只大鼠;同时定量分析骨髓中真皮多能干细胞的含量。结果:作为受体的60只大鼠全部进入结果分析。成功地构建了增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体,并发现其可转染和标记真皮多能干细胞。增强型绿色荧光蛋白标记的真皮多能干细胞在移植后4周内在大鼠体内的分布可被有效地检测,荧光激活细胞分类结果显示全身照射组大鼠骨髓中真皮多能干细胞的含量从移植后5d～4周均明显高于正常对照组大鼠(P<0.01)。结论:增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体可有效地标记真皮多能干细胞,并能很好地示踪和定量分析移植到大鼠体内真皮多能干细胞的分布情况。