胰腺癌细胞ezrin基因转录调控区及其gRNA靶位点鉴定

摘要

目的ezrin基因在胰腺癌中过表达,其上游序列对于基因表达具有重要作用。文章拟敲除胰腺癌细胞ezrin基因转录调控区,鉴定其基因编辑gRNA靶位点。方法将携带ezrin基因上游片段的报告基因表达载体瞬时转染胰腺癌细胞Panc-1,采用双荧光素酶报告基因检测系统,鉴定ezrin转录调控区。使用在线软件预测ezrin转录调控区上下游gRNA靶位点,构建基因编辑重组质粒pX459-sgRNA-L和pX458-sgRNA-R。将重组质粒共转染Panc-1细胞,针对gRNA靶位点进行基因组DNA的PCR扩增和亚克隆测序分析,鉴定ezrin转录调控区的靶向敲除。向转染重组质粒的Panc-1细胞中加入嘌呤霉素初步筛选,采用水溶性四氮唑盐法检测细胞增殖能力。结果荧光素酶报告基因检测结果显示,Panc-1细胞中ezrin基因-1297/-1186片段对SV40启动子和ezrin启动子具有转录增强作用。亚克隆测序结果显示,携带ezrin转录调控区gRNA靶位点序列的重组质粒共转染至Panc-1细胞,细胞基因组DNA出现片段缺失,位于gRNA-L和gRNA-R靶位点之间。细胞增殖实验结果显示,转染重组质粒的Panc-1细胞,其增殖能力显著受到抑制。胰腺癌Panc-1细胞ezrin基因-1297/-1186为转录调控区,其上游gRNA-L和下游gRNA-R序列可作为基因编辑靶点。结论实现了ezrin转录调控区的靶向敲除,Panc-1细胞增殖能力的抑制有可能与ezrin转录调控区的敲除有关。