葡萄糖-6-磷酸脱氢酶稳定敲低对肾透明细胞癌细胞迁移的抑制作用

摘要

目的肾透明细胞癌(ccRCC)是一种代谢性疾病,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)与ccRCC的发生发展及患者的不良预后呈正相关。文章首次构建了G6PD缺陷型ccRCC稳定细胞株,检测其迁移表型。方法 Oligo Engine RNAi设计针对人G6PD基因3'端非编码区的siRNA及无关siRNA序列,合成双链后通过BglⅡ和HindⅢ酶切位点插入p SP-GFP/Neo表达载体,构建Caki-1-G6PD siRNA细胞株及Caki-1-Negative control细胞株,进而转染并经G418筛选。应用Real-time RT-PCR、Western blot及酶活性方法,检测细胞株的G6PD表达和酶活性;Transwell方法检测细胞迁移表型、Western blot检测p-STAT3/STAT3表达。结果荧光显微镜下可见Caki-1-G6PD siRNA细胞与Caki-1-Negative control细胞形态良好,通过GFP表达量计算细胞转染效率约为45%~55%;48 h后细胞贴壁密度达90%,荧光表达略有增强,转染效率可达60%。光镜和荧光显微镜下亦可见细胞状态良好,GFP阳性率达95%。与Caki-1-Negative control细胞相比,Caki-1-G6PD siRNA细胞的G6PD mRNA表达量蛋白表达量和酶活性均显著降低(P<0.05)。与Caki-1-Negative control细胞相比,Caki-1-G6PD siRNA迁移细胞的相对数量明显降低[(64.0±4.2)个vs(30.0±2.9)个,P<0.01],p-STAT3/STAT3值亦明显下降[(0.45±0.05)vs(0.24±0.01),P<0.01]。结论文章首次成功构建了G6PD稳定敲低和迁移能力低下的Caki-1细胞系,其G6PD敲低所致ccRCC细胞迁移能力降低与STAT3信号相关。