拓扑异构酶ⅡαRNA小分子干扰片段表达载体的构建与鉴定

摘要

目的:构建拓扑异构酶ⅡαRNA小分子干扰片段(TopoⅡαsiRNA)的真核表达载体并进行表达鉴定.方法:(1)根据GeneBank表达序列标签(Esr)数据库设计4对TopoⅡα基因siRNA的小分子片段.(2)采用RT-PCR方法检测细胞中的TopoⅡα表达并确定受试细胞.(3)将最佳沉默siRNA片段克隆到psilencer4.1-CMV-neo载体上,质粒DNA直接测序确定克隆成功.(4)采用脂质体法将TopoⅡα-siRNA DNA转染至受试细胞.并采用有限稀释法和G418加压筛选并培养稳转及对照细胞.(5)分别采用RT-PCR和Western blot方法测定稳转及对照细胞系TopoⅡαmRNA和蛋白表达.结果:(1)SKOV3/DDP细胞中TopoⅡαmRNA表达最高,与其亲本细胞SKOV3相比较,差异有统计学意义(P＜0.05).(2)以TopoⅡα-4302siRNA片段沉默TopoⅡαmRNA表达最强(P＜0.01).(3)重组阳性克隆经测序鉴定证实TopoⅡα-4302siRNA克隆成功.(4)RT-PCR和Western blot检测结果显示转染TopoⅡα-4302siRNA质粒DNA后能抑制SKOV3/DDP细胞中的TopoⅡα基因表达.结论:成功构建psilencer4.1-CMV-neo-TopoⅡα-siRNA重组表达载体并稳转至SKOV3/DDP细胞系.为下一步探讨TopoⅡα基因在卵巢癌多药耐药中的作用提供了实验基础.