热带假丝酵母肉毒碱乙酰基转移酶基因的删除及功能鉴定

摘要

缺乏高效基因删除技术是限制热带假丝酵母菌株代谢工程育种的重要因素.论文发展了一种新型的基因删除技术并利用该技术成功删除了肉毒碱乙酰基转移酶的两个等位基因.首先PCR扩增标记基因(URA3)的3 '端324 bp序列作为基因删除辅助序列(gda序列),同向插入到URA3基因的5 '端,在此基础上构建两端含有CAT基因同源臂序列的基因删除突变盒,转化宿主菌XZX,获得CAT基因单拷贝和双拷贝敲除的突变株.PCR鉴定和DNA测序结果表明,获得的URA3基因弹出后的突变株,仅在基因组重组位点上残留一个gda序列.进一步鉴定了突变株的生理性能,单拷贝敲除菌株CAT活性较亲本下降80％,但在葡萄糖或烷烃上的生长性能并不受显著影响.双拷贝缺失菌株CAT活性完全丧失,不能利用烷烃生长,同时在葡萄糖培养基中的生长受到显著影响,最终生物量达到7.56(OD600),仅为出发菌株的57.8％.