双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)的真核表达、纯化及鉴定

摘要

[目的]获得真核表达的Flag-PKR融合蛋白,以用于流感病毒相关的PKR信号通路调控机制研究.[方法]以RT-PCR方法扩增PKR目的基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0-Flag中.将所构建的重组质粒pcDNA3.0-Flag-PKR转染293T细胞,利用Flag抗体偶联的琼脂糖凝胶(anti-Flag M2-Agarose)纯化Flag-PKR融合蛋白,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot及体外活性鉴定.[结果]重组质粒转染293T细胞,Western blot显示表达出的融合蛋白能够被抗Flag的抗体特异性识别,其相对分子量约为69kDa,与Flag-PKR融合蛋白大小相符;体外磷酸化试验表明,Flag-PKR融合蛋白能够发生自动磷酸化.[结论]在293T细胞中表达、纯化了有活性的Flag-PKR融合蛋白,为PKR信号通路的研究奠定了基础.