猪TNNC2基因的克隆及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达

摘要

根据GenBank上猪TNNC2(fast skeletal muscle troponin c)基因序列(GenBank accession No.DQ629177)设计1对引物,采用RT-PCR方法克隆得到617 bp TNNC2 cDNA片段(GcnBank accession No.EF673726),包括完整的开放阅读框(ORF),与GenBank上公布的猪TNNC2基因(GenBank accession N0.AY575058)的ORF核苷酸序列同源性达99%,并发现ORF内的5个点突变,319位点T→C,320位点G→A,321位点C→T,导致氨基酸107位Ala(丙氨酸)→Met(蛋氨酸),322位点A→G为同义突变,433位点A→T,导致氨基酸144位Glu(谷氨酸)→Asp(天冬氨酸).根据已获得的TNNC2基因ORF序列,重新设计引物扩增得到包含BamH I和EcoR I酶切位点的完整ORF,将其首先克隆到pMD18-T载体中,经菌液PCR筛选和酶切鉴定后,用BamH I和EcoR I将目的片段切下,再克隆到原核表达载体pRSET A中构建重组表达质粒pRSETA-TNNC2.将重组质粒转化大肠杆菌(Escheriehia coli)BL21(DE3),IPTG不同诱导条件37℃诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析证实重组表达质粒pRSET A-TNNC2表达出约24 kD的融合蛋白,最佳诱导时间为4 h,最佳的IPTG诱导浓度为0.6 mmol/L,表达产物以可溶性蛋白的形式存在.