PMA-qPCR方法检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌活菌的研究

摘要

将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量(qPCR)相结合定量检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌(Psa)活菌的数量.通过优化PMA最佳浓度、暗孵育时间、曝光时间,确定PMA-qPCR区别溃疡菌活、死菌的最佳条件.结果表明,Psa经98.3℃沸水浴处理13 min可完全致死,Psa死菌浓度为1×107 CFU/mL时PMA与死菌共价交联的最佳浓度为105μg/mL,最佳暗育时间为8 min,最佳曝光时间为20 min,在此条件下死菌DNA无扩增,而对活菌DNA扩增无影响;Psa质粒标准品建立的线性回归方程为Y=-3.2204x+37.73,R 2=0.9955,最低可检出6.39×102拷贝/μL的溃疡菌;建立的PMA-qPCR方法最低可检出2.38×102拷贝/μL的溃疡菌;采用人工染菌枝条样品的最低检出限为6.30×104 CFU/mL,与菌落计数检测结果相符.