低氧诱导c-Kit^+骨髓间充质干细胞增殖及旁分泌中ROCK信号的作用

摘要

cqvip:背景:研究显示低氧能刺激骨髓间充质干细胞增殖,但具体机制尚不清楚。ROCK信号对细胞增殖、凋亡等具有重要影响,当前对ROCK信号与骨髓间充质干细胞的生物学功能研究较少。目的:分析ROCK信号在低氧诱导c-Kit+骨髓间充质干细胞增殖及旁分泌中的作用。方法:贴壁法获得大鼠股骨骨髓间充质干细胞,应用磁激活细胞分选法获得c-Kit+亚群,细胞培养于常氧(体积分数21%O_2)及低氧(体积分数2%O_2)条件下,并用ROCK信号抑制剂Fasudil (10μmol/L)处理细胞。观察:①Westernblot检测p-MLC2(T18/S12)和MLC2蛋白表达,以p-MLC2(T18/S12)/MLC2比值变化反映ROCK信号的活化情况;②细胞计数分析细胞增殖,Westernblot检测细胞增殖标记物PCNA和细胞周期相关蛋白的表达;③流式细胞术检测细胞周期的变化;④ELISA检测细胞培养上清中血管内皮生长因子、转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子水平,了解细胞的旁分泌情况。结果与结论:成功分选出大鼠c-Kit+骨髓间充质干细胞。①相对于常氧而言,低氧显著下调MLC表达和上调p-MLC(T18/S19)表达进而增加p-MLC(T18/S19)/MLC2比值;②低氧促进c-Kit+骨髓间充质干细胞的增殖,表现为细胞数量增多和PCNA蛋白表达上调,Fasudil减弱了低氧诱导的c-Kit+骨髓间充质干细胞增殖,使细胞周期阻滞于S期并抑制CDK2、CDK4和上调p16的表达;③低氧显著促进c-Kit+骨髓间充质干细胞分泌上述3种细胞因子,Fasudil减弱低氧诱导的血管内皮生长因子和转化生长因子β1但上调碱性成纤维细胞生长因子的分泌。实验结果提示低氧刺激促进c-Kit+骨髓间充质干细胞增殖和旁分泌并活化ROCK信号;Fasudil抑制低氧诱导的细胞增殖和旁分泌作用,提示ROCK信号对c-Kit+骨髓间充质干细胞的增殖和旁分泌具有重要的正性调节作用。