应用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒

摘要

目的:AdEasy系统可在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组,经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞获得重组病毒,极大简化了载体的构建过程。实验利用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒。方法:实验于2006-08/2007-05在青岛大学医学院病毒学实验室完成。①实验材料:清洁级SD大鼠5只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,骨架质粒pAdeasy-1,大肠杆菌BJ5183和DH10B,人胚肾293细胞均由青岛大学医学院微生物教研室罗兵教授惠赠。②实验方法:从脂多糖刺激培养的大鼠脾细胞中提取细胞总RNA,应用反转录多聚酶链反应技术扩增白细胞介素10cDNA,定向亚克隆至pAdtrack-CMV中构建腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-IL-10,酶切线性化后转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌中,获得重组腺病毒质粒pAd-IL-10,Lipofectamin包装转染293细胞,获得重组腺病毒vAd-IL-10,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。将293细胞接种于96孔板中,每孔1×104个细胞,浓缩后的病毒贮存液按不同比例稀释加至培养板中,测定重组腺病毒滴度。用重组腺病毒vAd-IL-10感染293细胞3d后,以TRIzol一步法提取细胞总RNA,所获RNA加入DNaseⅠ消化处理可能污染的DNA后,PCR产物行琼脂糖电泳检测白细胞介素10 mRNA的表达。结果:①重组腺病毒的包装及滴度测定:经限制性内切酶转染293细胞16h后,荧光显微镜观察到细胞中有GFP荧光,可间接反映目的基因的表达。将病毒上清反复感染293细胞扩增重组腺病毒,通常传至第4～5代于接种病毒后24～48h,几乎可观察到所有细胞出现荧光,此时收获病毒,重组病毒命名为vAd-IL-10。vAd-IL-10滴度为5.5×108pfu/mL,vAd-GFP滴度为9.0×108pfu/mL。②目的基因RT-PCR产物的鉴定:提取重组腺病毒感染293细胞总RNA,RT-PCR扩增后琼脂糖电泳显示特异性580bp预计大小的片段,表明该重组腺病毒可在293细胞中有效转录。结论:利用AdEasy腺病毒载体系统成功构建了携带白细胞介素10基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度的重组腺病毒vAd-IL-10,可在293细胞中有效转录。