瘢痕疙瘩成纤维细胞生长与小干扰RNA分子抑制细胞周期蛋白D1表达的影响

摘要

目的:细胞周期蛋白是细胞周期调控的决定性因子,RNA干涉是一种高效特异的基因沉默技术,能诱使细胞表现出特定基因缺失表型。通过RNA干扰阻断细胞周期蛋白D1基因表达,观察瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和细胞周期的影响。方法:实验于2006-07/2007-05在南方医科大学基因工程研究所(BSL-2级)完成。①实验材料:小干扰性RNA设计采用软件是ambion公司的在线软件siRNA target finder,合成采用化学合成法,委托上海吉凯基因有限公司合成,再经过变性退火处理后得到双链小干扰性RNA;瘢痕疙瘩成纤维细胞标本取自南方医院整形外科瘢痕疙瘩患者(均获得患者或其家属同意)。②实验过程及分组:将瘢痕疙瘩成纤维细胞应用脂质体法将针对细胞周期蛋白D1基因的小干扰RNA分子转染为实验组,细胞用等量脂质体处理为脂质体组,未处理组作为对照。③实验评估:于转染后24,48,72h,光学显微镜观察细胞形态变化;流式细胞术分析细胞周期;MTT法检测成纤维细胞的活性并绘制细胞生长曲线。结果:①转染特异性小干扰RNA后,细胞形态发生了异常改变,细胞由正常的长梭形变为圆形或椭圆形,提示可能是凋亡或坏死细胞。②转染后细胞周期G1期延长,S期缩短。转染特异性小干扰RNA24,48,72h后G1期细胞高于未处理组(依次为60.13%,66.22%,67.53%,54.53%);S期细胞低于未处理组(依次为18.25%,17.11%,11.15%,22.31%),表明细胞阻滞在G1期,进入S期细胞减少。③小干扰RNA-细胞周期蛋白D1转染后MTT法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞增值明显受到抑制,细胞生长曲线图表明,转染特异性小干扰RNA组细胞生长明显减缓。结论:特异性小干扰RNA分子能够抑制细胞周期蛋白D1基因的表达,使细胞阻滞于G1期,并诱导细胞凋亡。