兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导为成骨细胞的生物学特征

摘要

背景:脊柱和创伤骨科的重建修复对骨的需求量极大,但现实的供需缺点和矛盾限制了植骨运用,急需找寻一种替代途径。目的:探索骨髓间充质干细胞体外分离培养的最佳实验条件,并观察其生物学特征。设计、时间及地点:细胞水平的体外组织工程实验,于2007-05/2008-05在苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成。材料:选择4周龄雄性新西兰大耳白兔,由苏州大学动物中心提供。方法:自股骨大转子及髓腔抽取新西兰大耳白兔骨髓,采用密度梯度离心法获取离心层骨髓单个核细胞,体外接种连续培养观察,原代接种后48h首次换液,此后每二三天全量换液;待细胞长至90%汇合时,用胰酶和EDTA混合液消化传代。主要观察指标:采用倒置显微镜下进行细胞生长形态观察,四唑盐比色法测定细胞活性并描绘细胞生长曲线;另选择P3代细胞进行成骨条件培养液培养4周,应用Gomori钙钴染色法鉴定成骨分化的标志物——碱性磷酸酶阳性细胞,应用Von-Kossa改良染色法测定钙节结。结果:分离培养的骨髓间充质干细胞生长形态和增殖活性良好,接种后的细胞由短梭形向长梭形、三角形乃至多角性发展,各代细胞有明显的生长潜伏期、对数增长期和平台期,细胞可以连续培养至P9代。经成骨诱导分化的细胞碱性磷酸酶染色阳性率为93%,矿化结节染色阳性。结论:骨髓间充质干细胞体外分离、扩增简单可行,可以定向诱导为成骨细胞。