内质网应激介导棕榈酸诱导的成骨细胞凋亡

摘要

目的 建立棕榈酸诱导成骨细胞凋亡的模型,探讨内质网应激在棕榈酸诱导成骨细胞凋亡中的作用.方法 选取小鼠成骨细胞MC3T3-El 14为研究对象,分组方法如下:(1)根据棕榈酸(palmitate,PA)作用浓度分为对照组(0μmol/L PA)、100 μmol/L PA组、250 μmol/L PA组和500 μmol/L PA组,分别孵育24 h;随后选择棕榈酸作用敏感浓度500 μmol/L,孵育成骨细胞不同时间(0、6、12、24 h).(2)应用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)进一步验证棕榈酸对成骨细胞增生和凋亡的影响.选择4-PBA作用敏感浓度5mmol/L,根据是否经4-PBA预处理分为对照组(0 μmol/L PA,0 mmol/L 4-PBA)、4-PBA组(0μmol/L PA,5 mmol/L 4-PBA)、4-PBA+ PA组(500μmol/L PA,5 mmol/L 4-PBA)和PA组(0 mmol/L 4-PBA,500 μmol/L PA)干预24 h.培养结束后,采用CCK-8法检测细胞增生活力;Annexin V/PI双染色法流式细胞术检测细胞凋亡率;Realtime quantitative PCR检测各组细胞内质网应激相关基因GRP78、CHOP、caspase-12 mRNA的表达.结果 与对照组相比,250和500 μmol/L棕榈酸干预成骨细胞24 h可明显降低细胞增生活力(A值:1.015±0.068,0.816±0.108,0.479±0.050,P＜0.05),细胞凋亡率则分别增高了6.70％±1.40％,15.30％±1.28％ (P＜0.05),CHOP和GRP78mRNA的表达水平呈剂量依赖性增高(均P＜0.05),而caspase-12 mRNA的表达水平则有所降低(P＜0.05);100μmol/L PA组增生活力、凋亡率及各基因表达量差异均无统计学意义(P＞0.05).与对照组相比,用500 μmol/L棕榈酸干预成骨细胞6、12、24 h后,细胞增生活力呈时间依赖性下降(A值:0.952±0.064,0.788±0.043,0.683±0.044,0.482±0.052,P＜0.05);凋亡率则分别增高3.63％±1.45％,9.0％±2.31％,15.7％±0.61％(均P＜0.05);CHOP mRNA表达水平呈时间依赖性增高(P＜0.05),GRP78 mRNA的表达水平在12h开始升高,24 h达到峰值(P＜0.05),caspase-12 mRNA表达水平则在12h达到峰值,24 h后开始下降(P＜0.05).与PA组相比,4-PBA+ PA组成骨细胞增生活力升高(A值:0.355 ±0.029 vs.0.451 ±0.049,P＜0.05),凋亡率降低8.6％±2.05％ (P ＜0.05),GRP78、CHOP和caspase-12mRNA的变化水平则呈现与单纯棕榈酸干预组相反趋势(均P＜0.05).结论 棕榈酸可能通过内质网应激途径诱导成骨细胞凋亡,4-PBA可以通过抑制内质网应激在一定程度上减少棕榈酸诱导的成骨细胞凋亡.