氧化应激下视网膜色素上皮细胞外泌体对视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子A及丝氨酸/苏氨酸激酶表达的影响

摘要

目的观察氧化应激下视网膜色素上皮细胞（RPE）外泌体对RPE细胞血管内皮生长因子（VEGF）-A及丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt）表达的影响。方法培养人RPE（ARPE-19）细胞,细胞培养基中加入浓度为2.5μmol/L鱼藤酮诱导ARPE-19细胞发生氧化应激损伤。收集上清液,采取梯度超速离心法分离纯化外泌体。应用透射电子显微镜观察外泌体形态;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测ARPE-19细胞外泌体表面特异性标志蛋白CD63的表达。将氧化应激下ARPE-19细胞外泌体与ARPE-19细胞共培养作为实验组,等量正常RPE细胞外泌体与ARPE-19细胞共培养作为对照组。采用噻唑蓝比色法检测ARPE-19细胞的细胞活力,以酶联免疫检测仪测量波长570 nm处各孔的吸光度[A,旧称光密度（OD）]值表示;免疫荧光染色法和Western blot检测ARPE-19细胞VEGF-A、Akt蛋白表达;实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测ARPE-19细胞VEGF-A、Akt m RNA表达。结果透射电子显微镜观察发现,ARPE-19细胞外泌体呈圆形或椭圆形膜性小囊泡,直径50~150 nm。Western blot检测结果显示,ARPE-19细胞外泌体表面表达特异性标志蛋白CD63。噻唑蓝比色法结果显示,实验组、对照组ARPE-19细胞在波长570 nm处的A值分别为0.582±0.015、0.787±0.032。实验组ARPE-19细胞在波长570 nm处的A值较对照组明显降低,差异有统计学意义（t=20.886,P＜0.05）。免疫荧光染色法检测结果显示,与对照组比较,实验组ARPE-19细胞VEGF-A蛋白表达明显增强,Akt蛋白表达明显减弱。Western blot检测结果显示,与对照组比较,实验组ARPE-19细胞VEGFA蛋白相对表达量明显升高,Akt蛋白相对表达量明显降低,差异均有统计学意义（t=3.822、6.527,P＜0.05）。RT-PCR检测结果显示,与对照组比较,实验组ARPE-19细胞VEGF-A m RNA相对表达量明显升高,Akt m RNA相对表达量明显降低,差异均有统计学意义（t=8.805、-7.823,P＜0.05）。结论氧化应激下ARPE-19细胞外泌体可抑制正常AREP-19细胞增生,上调VEGF-A表达,下调Akt表达。