原位缺口平移标记断裂DNA技术及其在检测流行性出血热尸检和实验动物组织中细胞凋亡和早期死亡的应用

摘要

原位缺口平移技术（ＩＳＮＴ）已被用于检测细胞核中ＤＮＡ断裂鉴别尸检组织中细胞的凋亡和坏死断裂、流行性出血热（ＥＨＦ）组织中存在散在单个细胞变性死亡和灶性梗死样坏死，前者带有细胞凋亡的特征。本文以ＥＨＦ肝脏和实验性病毒感染鼠脑组织为例，应用缺口平移法，在ＤＮＡ聚合酶或Ｋｌｅｎｏｗ酶的作用下，将地高辛标记的ｄＵＴＰ掺入合成到ＤＮＡ的断裂部位，通过碱性磷酸酶标抗地高辛抗体免疫组化法显示细胞ＤＮＡ的断裂，检测和鉴别细胞的凋亡和坏死。为分析死后解剖时间间隔及组织固定时间对该方法的影响，本文选用死后２～１４０ｈ尸检、经常规固定石蜡包埋后存放１０～３５年的标本和在１０％福尔马林固定了１０～３５年之后再进行常规处理的标本。实验时用蛋白酶Ｋ（ＰＫ）消化前后对比并分别在标记反应液中略去ＤＮＡ聚合酶作为阴性对照，用ＤＮＡ酶消化组织人为制造ＤＮＡ缺日作为阳性对照。结果发现，未经ＰＫ消化的组织，仅灶性肝细胞核ＩＳＮＴ标记阳性，经ＰＫ消化后，散在的带有凋亡特征的肝细胞胞核也出现阳性，灶性肝细胞胞核标记染色增强，但无论是蛋白酶消化与否，明确梗死样坏死的肝细胞均不被标记。结果还发现，死后２～２４ｈ内尸检组织和长时间（１０～３４年）存放的石?