人组织型纤溶酶原激活剂-水蛭素融合基因的构建及其在毕赤酵母中的表达

摘要

构建并表达兼有溶栓和抗凝活性、减少出血副作用的人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和水蛭素(HV2)的融合蛋白.通过提取总RNA和RT-PCR获得t-PA基因,与HV2基因通过活化凝血因子X(FXa)识别序列(IEGR)的对应碱基序列连接构成融合蛋白基因,融合蛋白基因经pGEM-T、pIC9克隆至表达载体pIC9K上,电转导入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115.转化子摇瓶内甲醇诱导表达.纤维蛋白平板溶圈法和纤维蛋白凝块法分别检测溶栓和抗凝活性.琼脂糖凝胶电泳结果显示克隆的t-PA基因片段大小为1700bp,序列测定结果表明其35位氨基酸由文献报道的精氨酸突变为色氨酸.限制性酶切和PCR鉴定结果均表明融合蛋白基因已克隆入表达载体和宿主菌.甲醇利用实验、G418抗性筛选获得多拷贝甲醇利用快型克隆.甲醇诱导表达产物具有纤溶活性并可被抗t-PA抗体抑制.完整融合蛋白无抗凝活性,但以FXa裂解后可释放抗凝活性.同时,融合蛋白以单链和双链两种形式存在.融合蛋白在血栓部位特有的FXa作用下靶向释放抗凝活性,具有溶栓抗凝双功能,有望降低临床出血副作用.