水蛭素基因毕赤酵母表达载体的构建及高拷贝稳定整合菌株的筛选

摘要

目的 :构建水蛭素变异体HV1毕赤酵母分泌型表达载体 ,获得高拷贝稳定整合菌株 ,为大量获得重组水蛭素蛋白 ,进行功能研究及其临床应用奠定基础 .方法 :根据水蛭素HV1的氨基酸序列及毕赤酵母偏爱的密码子 ,设计HV1编码基因 ,分为 8条寡核苷酸片段进行DNA合成 ,经磷酸化、退火、连接和PCR扩增得到优化的HV1全长基因 ,测序结果正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游 ,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K ,得到pPIC9K HV1 ,SalI线性化后转化毕赤酵母GSM1 1 6 8,G4 1 8梯度筛选转化菌 ,PCR鉴定目的基因的整合 .结果 :获得了水蛭素毕赤酵母表达载体pPIC9K HV1 ,G4 1 8抗性筛选得到高拷贝菌株 ,PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中 .结论 :成功构建了水蛭素HV1毕赤酵母表达载体 ,获得了高拷贝稳定整合菌株 。