鼠羧肽酶原B在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定

摘要

为了在毕赤酵母中表达鼠羧肽酶原B(procarboxypeptidase B,proCPB)蛋白,以RT-PCR法从SD鼠胰腺细胞中克隆了proCPB基因,将其插入pPIC9载体,PEG1000介导转入毕赤酵母GS115细胞,在甲醇的诱导下,实现了proCPB在毕赤酵母中的成功表达.通过发酵条件的优化,使用BMGY(pH6.0)培养基,添加0.5%的酪蛋白水解物,于28℃,在起始OD600达10.0时,每隔12h补加0.5%的甲醇,重组酵母GS115-proCPB表达的产物量可达到最高(500mg/L),表达时间可达120h,表达的目的蛋白占总蛋白的94%以上.通过纯化条件的优化,采用两步疏水层析,可使目的蛋白的纯度达96%以上,蛋白得率达38%,重组proCPB活化后所得CPB的比活力可达110u/mg(CPB标准品为180u/mg).相对分子量测定表明重组蛋白的分子量与理论值极相近,N-端氨基酸测序进一步表明proCPB基因在毕赤酵母中得到了正确的表达和翻译后加工修饰.