表达猪表皮生长因子重组乳酸乳球菌的构建及其对结肠炎模型小鼠肠道损伤的修复作用

摘要

本试验旨在构建表达猪表皮生长因子(pEGF)的重组乳酸乳球菌(L.lactis),并评价其对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型小鼠肠道损伤的修复作用,为将表达pEGF重组L.lactis应用于断奶仔猪肠道保护提供重要的依据.设计含有3个拷贝数的pEGF同向串联基因序列,并进行L.lactis密码子优化,将合成的3pEGF基因片段与表达载体pNZ8148连接,构建表达pEGF的重组L.lactis.选用32只B ALB/c小鼠,随机分为4组,每组8只.采用4％的DSS建立小鼠结肠炎模型,各组小鼠具体处理如下:正常对照组,试验第1～12天饮用 自来水;DSS模型对照组,试验第1～7天饮用4％的DSS水溶液,第8～12天饮用自来水;L.lactis组,饮水按照DSS模型对照组处理,同时每天口服1×1012 CFU L.lactis,连续12 d;重组L.lactis组,饮水按照DSS模型对照组处理,同时口服1x1012CFU表达pEGF的重组L.lactis,连续服12 d.结果显示:1)通过序列鉴定可知,3pEGF基因成功转入L.lactis;Western blot分析表明所表达的pEGF能与特异性抗体相结合,初步证明该重组蛋白具有活性.2)与正常对照组相比,DSS模型对照组小鼠结肠长度显著降低(P＜0.05);与DSS模型对照组相比,重组L.lactis组小鼠结肠长度显著增加(P＜0.05).3)与正常对照组相比,DSS模型对照组小鼠结肠闭锁蛋白(occludin)浓度显著降低(P＜0.05),D-乳酸(D-LAC)浓度显著升高(P＜0.05),二胺氧化酶(DAO)活性极显著升高(P＜0.01);与DSS模型对照组相比,重组L.lactis组小鼠结肠occludin浓度显著升高(P＜0.05),D-LAC浓度显著降低(P＜0.05),DAO活性极显著降低(P＜0.01).4)与正常对照组相比,DSS模型对照组小鼠结肠白细胞介素-10(IL-10)浓度极显著降低(P＜0.01),白细胞介素-4(IL-4)浓度显著降低(P＜0.05),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度极显著增加(P＜0.01);与DSS模型对照组相比,重组L.lacits组小鼠结肠IL-10浓度极显著增加(P＜0.01),IL-4浓度显著增加(P＜0.05),TNF-α浓度有降低的趋势.由此可见,本试验成功构建了表达pEGF的重组L.lacits,重组pEGF具有良好生物活性;小鼠口服表达pEGF的重组L.lacits 可抑制结肠的缩短,改善结肠结构和通透性,调节细胞因子浓度到达正常水平,这说明表达pEGF的重组L.lacits维护了肠道屏障功能的完整性,对损伤的肠道具有一定修复作用.