1.2倍基因组长度C基因型乙型肝炎病毒重组体构建及其在HepG2细胞中表达和复制

摘要

目的 构建基于pBlueBac4.5质粒的1.2倍基因组长度C基因型乙型肝炎病毒(HBV)重组体,并研究其在HepG2细胞中的表达和复制.方法 以重组质粒pwT上的1.2倍基因组长度C基因型HBV DNA序列和pBtM.5HBV1.3(D基因型)上的pBlueBac4.5载体序列为模板,构建重组质粒pBB4.5HBV1.2(C基因型).用FuGENE(R)HD瞬时转染法,将pBB4.5HBV1.2导人HepG2细胞.用化学发光免疫分析法、Southern印迹杂交法、荧光定量PCR法,分别检测转染后不同时间点HBsAg和HBeAg、HBV复制中间体及HBV DNA水平.此外,对转染时重组质粒用量进行优化.结果 酶切和序列分析证实,pBtM.5HBV1.2重组质粒构建成功.初步转染实验证实,在转染细胞培养上清中可检测到HBsAg和HBeAg.优化后转染条件为:使用60 mm细胞培养皿,8～11 μg pBB4.5HBV1.2,质粒与转染试剂5:9(μg:μl).在此条件下,5 d实验周期内可检测到HBsAg和HBeAg持续表达(峰值一般出现在转染后第3天)、HBV DNA持续复制(106～108拷贝/ml)及HBV DNA复制中间体形成.结论 在HepG2细胞中,建立了以杆状病毒转移载体pBlueBae4.5为基础的1.2倍基因组长度C基因型HBV体外培养体系,有望为研究HBV耐药、筛选新抗病毒药物等提供新技术平台.