12-脂氧合酶抑制剂ML355对小鼠经脂多糖诱导炎症反应的拮抗效应

摘要

目的探讨12-脂氧合酶（12-LOX）抑制剂ML355对小鼠经脂多糖（LPS）诱导的炎症反应的拮抗效应及其分子机制。方法①体内实验:将24只成年雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为对照组〔腹腔注射100 μL二甲亚砜（DMSO）后1 h再给予0.9%的生理盐水〕、LPS组（腹腔注射LPS 20 mg/kg）、ML355预处理组（给予LPS前1 h腹腔注射ML355 15 mg/kg、30 mg/kg进行预处理）。制模后12 h处死小鼠, 收集外周血、腹腔灌洗液和腹腔巨噬细胞（PMs）, 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组血浆和腹腔灌洗液中12-羟基二十碳四烯酸（12-HETE）含量、腹腔灌洗液中γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素（IL-1β、IL-6、IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及血清中IFN-γ、IL-1β水平, 采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组小鼠PMs中IFN-γ、IL-1β及花生四烯酸-15-脂氧合酶（Alox15）的mRNA表达。②体外实验:体外培养小鼠原代PMs, 按随机数字表法分为对照组（加入终浓度为0.3%的DMSO）、LPS组（给予LPS 20 mg/L）、ML355预处理组（给予LPS前1 h加入25 μmol/L、50 μmol/L的ML355预处理）。于LPS作用不同时间点收集各组细胞上清液和细胞团块, 用细胞计数试剂盒- 8（CCK-8）检测ML355对PMs细胞存活率的影响, 采用ELISA法检测各组PMs中12-HETE、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10的含量, 用qRT-PCR检测各组细胞中IFN-γ、IL-1β及Alox15的mRNA表达, 用蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测12/15-脂氧合酶（12/15-LOX）及丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）的蛋白表达。结果①体内实验:作用12 h, LPS组血浆和腹腔灌洗液中12-HETE以及腹腔灌洗液中炎性因子、血清中IFN-γ、IL-1β含量均较对照组显著增加。与LPS组比较, 15 mg/kg和30 mg/kg ML355预处理后血浆和腹腔灌洗液中12-HETE及血清中IFN-γ含量均明显减少〔12-HETE:血浆（mg/L）为11.59±1.80、11.58±1.75比18.59±1.68, 腹腔灌洗液（μg/L）为355.80±59.47、196.30±88.98比712.10±44.55;血清中IFN-γ（ng/L）:147.60±2.94、114.20±2.94比326.40±2.22, 均P＆0.05〕, 用30 mg/kg ML355预处理后小鼠腹腔灌洗液中IFN-γ水平明显降低（ng/L:228.70±6.94比309.80±16.37, P＆0.05）;qRT-PCR结果显示, 给予LPS后, PMs中IFN-γ、IL-1β的mRNA表达水平明显升高, 用15 mg/kg和30 mg/kg ML355作用后均可明显下调IFN-γ及Alox15的mRNA表达水平〔IFN-γ mRNA（2-ΔΔCt）:1.25±0.25、0.33±0.07比2.32±0.13, Alox15 mRNA（2-ΔΔCt）:0.10±0.01、0.18±0.02比0.91±0.18, 均P＆0.05〕。②体外实验:与对照组比较, LPS刺激PMs 12 h后, 小鼠PMs上清液中12-HETE含量呈升高趋势, 但差异无统计学意义, 给予25 μmol/L ML355预处理12 h后小鼠PMs上清液中12-HETE含量较LPS组明显降低（μg/L:39.92±6.22比79.01±9.82, P＆0.05）;与对照组比较, LPS组小鼠PMs上清液中IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-6水平均明显升高, 给予50 μmol/L的ML355预处理后, PMs上清液中IFN-γ明显降低（ng/L:255.30±8.82比303.10±6.76, P＆0.05）;qRT-PCR和Western blotting结果显示, LPS刺激12 h后, PMs中炎性因子IFN-γ、IL-1β的mRNA表达较对照组明显上调, Alox15 mRNA表达无显著变化, 细胞外信号调节微酶（ERK）、p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶（JNK）的磷酸化水平及12/15-LOX蛋白表达均较对照组明显增加;与LPS组比较, 用50 μmol/L ML355预处理后IFN-γ、IL-1β的mRNA表达明显下调〔IFN-γ mRNA（2-ΔΔCt）:0.16±0.05比1.25±0.03, IL-1βmRNA（2-ΔΔCt）:4.57±0.19比7.8