蛋白质和DNA复合体在基因转移过程中的蛋白质组学和功能分析

摘要

非病毒基因传递的障碍之一是拥挤的细胞浆,在细胞浆里质粒需要积极传递才能进行基因表达。这个过程的发生,人们知道的相对比较少,但有研究已经证实了微管网络和动力蛋白是质粒从细胞浆进入细胞核所必需的。为了进一步研究质粒如何利用正常的生理途径进入转染的细胞中,试验通过蛋白质组学的方法来鉴定含有质粒复合体的蛋白质,即在转染后的15 min到4h之间,利用活细胞DNA-蛋白质pull-down分析来分离复合体,并进行质谱分析。结果表明,含有启动子序列的质粒,在电穿孔15 min时,能结合数百个独特的蛋白质,而缺少任何真核序列的质粒均不能结合蛋白质。特定蛋白包括微管的动力蛋白(如驱动蛋白和动力蛋白)、参与核运输的蛋白质(如importin 1、2、4、7,Crm1,RAN和一些RAN结合蛋白)、一些异质核内核糖核蛋白(hnRNP)、mRNA结合蛋白和转录因子。通过检测小干扰RNA(siRNA)或特异性的抑制剂蛋白质,以及显微注射荧光标记的质粒通过活细胞的粒子径迹,来确定参与蛋白质核定位和质粒运输蛋白质的意义。importinβ1是质粒运输和后来的核进入所必需的,importinα1在微管运输中没有作用,但是在最适质粒的核运输时是必需的。核输出蛋白CRM1,也能与转染质粒形成复合体,它是质粒沿着微管运输和核进入所必需的。研究结果表明,多种参与核运输的蛋白质能影响质粒在细胞内的运输和随后的核积累。