彗星电泳法检测H_2O_2对人淋巴细胞DNA损伤及其激光扫描共聚焦显微境下的观察和三维重建

摘要

目的 :应用彗星电泳法于荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察人淋巴细胞经H2O2 作用后的DNA损伤情况。 方法 :人淋巴细胞经不同浓度H2O2(0、10、20、40、80μmol/L)作用20min,或20μmol/LH2O2 作用不同时间(0、10、20、30min)后 ,采用彗星电泳法 ,荧光显微镜下观察、照相 ,对尾长、总彗星长度、尾距进行测量和分析。同时采用激光共聚焦显微镜(LSCM)进行观察和三维重建 ;比较了不同染料(PI、AO、EB、Hochest33258)的染色效果。 结果 :H2O2 作用浓度为0、10、20、40、80μmol/L时 ,尾距( x- ±s)分别为0.001±0.002、0.31±0.35、1.23±0.96、2.82±1.38、3.52±0.96(P<0.01) ;作用时间为0、10、20、30min时 ,尾距( x- ±s)分别为0.05±0.09、0.22±0.30、1.62±0.93、1.89±1.09(P<0.01)。尾长、总彗星长度也有显著性增加 ,经统计学检验 ,P<0.01。与荧光显微镜相比 ,LSCM下的"彗星"轮廓十分清晰 ;PI和EB染色效果较好。 结论 :H2O2 能剂量依赖性和时间依赖性地导致人外周血淋巴细胞DNA的明显断裂损伤。利用LSCM构建"彗星"的三维图像将更有利于DNA损伤的准确测量。鉴于染色效果的差异 。