大鼠His-Akt1重组蛋白的真核表达、蛋白纯化及活性鉴定

摘要

构建His-Akt1-pcDNA3.1真核表达载体,于HEK293细胞进行表达,Ni-NTA亲和纯化His-Akt1,并对Akt1进行活性鉴定.以Akt1(全长)-pcDNA3.1重组体为模板,采用PCR扩增目的基因,然后克隆入真核表达载体pcDNA3.1;将His-Akt1-pcDNA3.1转染HEK293细胞表达,Ni-NTA纯化His-Akt1,用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色及免疫印迹鉴定蛋白纯度;蛋白经透析后,免疫印迹检测Akt1 Ser473和Thr308磷酸化水平.His-Akt1-pcDNA3.1真核表达载体构建成功,在HEK293细胞中高效表达;考马斯亮蓝染色和免疫印迹结果显示,取2 mg过表达His-Akt1的蛋白混合液经Ni-NTA纯化后,加入含100 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱,可获得高纯度His-Akt1重组蛋白.上述His-Akt1重组蛋白经透析后,免疫印迹结果显示His-Akt1 Ser473和Thr308磷酸化水平(活化水平)均呈高水平.重组His-Akt1-pcDNA3.1真核表达载体成功构建,且蛋白高表达,His-Akt1经提取纯化后具有较高的酶活性.