人CLEC-2胞外段CRD原核重组蛋白纯化与多克隆抗体的制备和活性鉴定

摘要

人C型凝集素样受体(human C-type lectin-like receptor-2,hCLEC-2)是新克隆的Ⅱ型跨膜受体分子,研究表明它在病毒感染,血小板活化、聚集,肿瘤转移和信号转导等方面发挥重要作用。我们希望通过制备针对其胞外段CRD结构域的抗体来进一步研究该蛋白质的生物学功能及相关信号通路。因此,我们构建了pET23b-CRD重组表达质粒,将其转化到大肠杆菌BL21中,用于hCLEC-2-CRD-His融合蛋白的表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明,融合重组蛋白成功获得了高效表达,分子量在18 KD左右。经鉴定,我们发现hCLEC-2-CRD-His表达于包涵体中。为获得高纯度的可溶性蛋白,我们将包涵体溶于6 M盐酸胍,并用镍珠进行纯化。纯化后的蛋白经过透析后作为抗原,免疫新西兰兔制备抗血清,抗血清经蛋白G亲合层析纯化后,用Western Blot等方法进行鉴定,结果显示该抗体能特异性地检测到转染表达的GFP-hCLEC-2和GFP-CRD。通过使用该抗体,我们进一步发现,在用PMA和IL-4诱导单核细胞THP-1分化的过程中,内源性hCLEC-2蛋白水平下调,初步揭示了hCLEC-2的表达和单核细胞的分化存在一定的联系。因此,该抗体的成功制备将为进一步研究CLEC-2的生物学功能提供有利的条件。