邻单胞菌邻苯二酚1,2-双加氧酶基因(tfd C)的克隆及其在大肠杆菌中表达

摘要

根据已报道的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因(tfdC)序列,设计PCR引物,从一株邻单胞菌(Plesiomonas)的pL1质粒上扩增到tfdC基因片段,连接到pGEM-T载体上,并转化大肠杆菌JM109菌株,筛选到阳性克隆.序列分析结果表明,PCR产物全长801bp,有一个阅读框,编码255个氨基酸,与增氧产碱菌(Alcaligeneseutroplus)的tfdC基因相比,在693位相差一个碱基(C→A),导致编码产物在228位相差一个氨基酸.将目的片段克隆到pBluescrip-tIIKS质粒载体上,筛选到阳性克隆pBt12G,在大肠杆菌JM109中可表达邻苯二酚1,2-双加氧酶(C120)的活性;将翻译起始密码子为ATG的目的片段克隆到pET-30a质粒载体上,筛选到阳性克隆pET30A,在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中可表达目的蛋白.C120是芳香族化合物降解过程中的关键酶,为了进一步在草坪草中表达tfdC基因,利用草坪草降解环境中芳香族污染物,将该基因翻译起始密码子由GTG突变成ATG,突变后的基因在大肠杆菌中可正常表达C120的活性.