欧文氏菌2-酮基醛糖还原酶基因敲除的研究

摘要

根据已知基因序列，利用PCR技术，从克隆质粒和欧文氏菌(Erωinia sp.)SCB125染色体中重新扩增得到含有2-酮基醛糖还原酶A和B(2-KRA和B)基因的片段，分别用于基因表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体pBL并转化大肠杆菌DH5a后，获得高酶活表达。在证实发生了突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上，对其进行基因敲除的研究。在体外将链霉素抗性基因插入到tkrA内部使其突变失活并作为阳性筛选标记，再将此突变基因构建到分配不稳定型质粒pBR322上，导入宿主菌后与染色体上正常基因进行同源重组交换，筛选质粒丢失的阳性菌落进行进一步鉴定。这项工作将为阻断旁路代谢，实现从葡萄糖一步发酵产生维生素C前体2、酮基古龙酸(2-KLG)打下基础。