一种多拷贝毕赤酵母表达载体的构建及人脑源性神经营养因子的表达

摘要

利用PCR技术扩增出pPIC9K载体的HIS4-Kan序列片段,与pPICZα重组,构建结合了两个载体特点的适合体外构建多拷贝基因表达盒的毕赤酵母表达载体pPICZα1,改造后的载体含HIS4-Kan序列,能整合到酵母染色体上,具有筛选方便、外源基因多拷贝组建迅速、蛋白产物分泌表达和易纯化等优点.将人脑源性神经营养因子(hBDNF)的cDNA(357bp)克隆入载体pPICZα1,利用同尾酶BglⅡ、BamHⅠ不可逆连接方式,分别构建含有1、2、3、6个拷贝hBDNF表达盒的重组表达载体,电击法转化毕赤酵母GS115菌株,用G418和Zeocin筛选转化子,筛选到的阳性转化子用0.5%甲醇诱导,获得分泌型表达.表达产物类似于天然神经营养因子单体大小、分子量约14kD.多拷贝hBDNF表达盒的表达水平亦高于单拷贝hBDNF表达盒,ELISA和Western blot检测表明:表达的蛋白能与鸡抗人脑源性神经营养因子抗体特异结合,证实该表达蛋白具有hBDNF的免疫原性.