Dact2在肝癌中的表观遗传学变化及功能研究

摘要

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康。肝癌的发病机制很复杂，表现遗传学改变调控的wnt/β-catenin信号通路相关基因失活在肝癌发生中发挥了重要作用。Dact（Homo sapiens dapper，antagoni st of β-catenin）是wnt/β-catenin信号通路的负性调节基因家族。有研究表明Dact1和Dact3的表达分别受DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传学调控，具有抑制肿瘤发生的作用。但Dact2与肿瘤的关系研究文献报道很少，在肝癌中的表现遗传学变化及功能尚不清楚。
　　 目的：
　　 1.检测Dact2在永生化肝细胞系和肝癌细胞系中的表达及甲基化改变。
　　 2.检测Dact2在正常肝组织、癌旁组织及不同分化程度肝癌组织中的表达及意义。
　　 3.检测Dact2在肝癌组织中的甲基化改变。
　　 4.探讨肝癌组织中DNA甲基化与Dact2表达之间的关系。
　　 5.检测Dact2对肝癌细胞生长的影响。
　　 6.探讨Dact2抑制肝癌细胞生长的可能机制。
　　 方法
　　 1.RT-PCR和western blot检测细胞系中Dact2在甲基转移酶抑制剂5-aza-dc处理前后mRNA及蛋白的表达。
　　 2.甲基化特异性PCR（methylation specific PcR，MSP）检测细胞系和组织标本DNA中Dact2甲基化情况。
　　 3.免疫组织化学方法检测Dact2在正常肝组织、癌旁组织及不同分化程度肝癌组织中的表达分布。
　　 4.脂质体法转染Dact2真核表达载体，流式细胞分选结合G418筛选瞬时转染Dact2的细胞。
　　 5.克隆形成实验及BrdU掺入标记方法分析Dact2对细胞生长的影响
　　 6.Hoechst 33258染色分析Dact2对细胞凋亡的影响。
　　 结果：
　　 1.Dact2在肝癌细胞系中的表达及甲基化改变本课题选用5株肝癌细胞系：HepG2、SNU449、SMMC7721、SNU182、PLC-PRF-5和一株永生化的肝细胞系Lo.2。在mRNA水平，Dact2在SNU449细胞系中无表达，在HepG2、SNU182、SMMC7721表达较弱，在Lo.2和PLC-PRF-5细胞中表达正常；5-aza-dc处理后，HepG2、SMMC7721、SNU182细胞中Dact2较未处理时表达上调，而L0.2、PLC-PRF-5和SNU449中Dact2无改变。选取HcoG2和SNU182两株细胞系检测Dact2蛋白的表达，结果显示Dact2蛋白在5-aza-dc处理后上调，与mRNA水平的表达改变一致。MSP检测结果显示10.2和PLC-PRF-5中Dact2为非甲基化，HepG2、SNU449、SMMC7721、SNU182细胞系中存在甲基化改变，其中，SNU182、SNU449和SMMC7721细胞中同时有甲基化和非甲基化条带。Dact2启动子甲基化改变与基因表达呈对应关系。
　　 2.Dact2在肝癌组织标本中的表达及甲基化情况在表达部位上，Dact2在正常肝组织、癌旁组织和癌组织中表达均在细胞浆；在表达强度上，肝癌组织内Dact2表达较癌旁明显减低，两组比较有统计学意义（P<0.001）；在高分化和中分化肝癌组织中Dact2的表达显著高于低分化组（P<0.05），而与患者的年龄、姓别、肿瘤大小及HBV相关性肝癌无显著相关。38例肝癌组织中的Dact2甲基化率为60.5％；在16例表达下调的肝癌标本中检测到Dact2甲基化的有11例（68.75％）。
　　 3.恢复Dact2表达对肿瘤细胞生长的影响克隆形成实验结果显示恢复Dact2表达后hepG2细胞的克隆数量明显少于对照转染的空载体，Dact2对细胞长期生长抑制作用大于空载体的2倍。Brdu掺入标记后转染Dact2的阳性细胞为39.63％，明显少于空质粒组48.32％，两组比较有显著差异（P<0.05）。
　　 4.Hoechst 33258染色分析Dact2对细胞凋亡的影响转染Dact2后HcpG2的凋亡率为10.9％，而转染空质粒的凋亡率4.9％；SNU449细胞转染Dact2后细胞凋亡率为12.30％，转染空质粒的凋亡率12.10％，提示Dact2对细胞凋亡无明显影响。结论本课题检测了肝癌中Dact2的表达及DNA甲基化改变，5-aza-dc处理细胞系能恢复dact2的表达，表明在肝细胞癌中Dact2的表达受表现遗传学调控；恢复表达Dact2能够明显抑制肝癌细胞的增殖，但对凋亡无明显影响。以上结果为进一步研究Dact2在肝癌诊断和靶向治疗中的作用奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

前言

第一部分 Dact2在肝癌细胞系中的表达及甲基化检测

材料及方法

结果

讨论

小结

第二部分 Dact2在人原发性肝细胞癌组织中的表达及甲基化改变

材料及方法

结果

讨论

小结

第三部分 Dact2对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

材料及方法

结果

讨论

小结

结论

参考文献

文献综述一

参考文献

文献综述二

参考文献

攻读学位期间发表文章情况

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