人可溶性白细胞介素-4受体（sIL-4R）基因的克隆表达及白细胞介素-4受体（IL-4R）拮抗剂筛选模型的构建研究

摘要

本研究以人脐静脉内皮细胞总RNA为模板,通过RT-PCR得到编码IL-4Rα链胞外结构域的基因片段sIL-4R cDNA.测序结果同已知sIL-4R基因编码序列进行比较,发现第148位碱基发生A→G的突变,造成第50位氨基酸Ile突变成为Val,根据文献报道,IL-4R基因序列具有多种单核苷酸多态性(SNP),其中在IL-4Rα链的胞外区表现为Ile50Val,本实验测序结果同文献报道的sIL-4R基因序列的单核苷酸多态性一致.将sIL-4R基因片段插入甲醇酵母-大肠杆菌穿梭质粒pPIC9K,构建了重组质粒pPIC9K/sIL-4R,将重组质粒转化至甲醇酵母Pichiapastoris GS115,获得了重组菌株P.pastoris [pPIC9K/sIL-4R].经SDS-PAGE、Western blot分析显示分子量约为30kD,配基结合(Ligand bindm)实验结果表明:Mut<'s>分泌表达的重组sIL-4R具有配基结合的生物活性.将sIL-4R基因片段插至含有P<,R>P<,L>启动子的温敏型表达载体pBV220,获得重组质粒pBV220/sIL-4R,转化至E coli DH5α作为宿主进行蛋白表达.经42℃诱导和细胞裂解,重组sIL-4R以包涵体形式表达.S-PAGE分析表明,表达产物在24kDa处有特异蛋白条带出现,与已知sIL-4R分子量23717.75 Da基本一致,Western bloting及受体配基结合实验显示,重组sIL-4R具有免疫学及与配基结合的生物活性.利用本实验室构建的链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒pSGLgpp作为sIL-4R基因的表达载体.将sIL-4R基因片段插入到质粒pSGLgpp中gPP信号肽编码序列下游,利用gPP信号肽介导sIL-4R分泌表达.重组质粒转化至转化至S.lividans TK24原生质体,获得了重组菌S.lividans[pSGLgpp/sIL-4R].SDS-PAGE、Western bloting及受体配基结合实验结果表明,重组菌株能分泌表达分子量为23.7kD的重组sIL-4R,表达的sIL-4R具有免疫学活性和与配基结合的生物活性.对大肠杆菌及链霉菌表达的重组sIL-4R蛋白分别进行了分离纯化.经诱导培养和细胞裂解后,E.coli[pBV220/sIL-4R]表达呈包涵体重组蛋白,溶于盐酸胍后经SuperdexHR 75柱层析,复性后进行DEAE Sepharose FF层析,获得纯化的sIL-4R.S.lividans[pSGLgpp/sIL-4R]表达上清液经70%硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose FF层析、Superdex HR 75柱层析,得到纯化的sIL-4R.两种宿主菌表达的重组sIL-4R经SDS-PAGE均显示为单一条带,HPLC检测纯度达90%;N端15个氨基酸测序证明两种重组sIL-4R与天然sIL-4 N末端氨基酸序列完全一致.采用大肠杆菌表达的重组sIL-4R对致敏豚鼠哮喘模型进行喷雾治疗观察,初步实验显示有一定疗效.以链霉菌表达的重组sIL-4R蛋白作为靶位,建立了IL-4R拮抗剂筛选模型,已筛选269个合成化合物和453株微生物产物,经复筛获得1个阳性化合物和5株产生拮抗物质的菌株,阳性率达分别达0.37%和1.11%,.本研究首次在链霉菌和甲醇酵母成功分泌表达了sIL-4R,并构建了新型IL-4R拮抗剂筛选模型,具有较突出新颖性.对重组sIL-4R的分离纯化研究为该蛋白的实际应用奠定了良好基础.

目录

缩略语一览表

前言

材料与方法

结果与讨论

第一部分：sIL-4R基因在大肠杆菌中的克隆和表达

第二部分：sIL-4R基因在甲醇酵母中的克隆和表达

第三部分：sIL-4R基因在链霉菌的克隆表达

第四部分：重组sIL4R的纯化研究

一 sIL-4R理化性质及结构预测

二 分离纯化链霉菌表达的重组sIL-4R

三 分离纯化大肠杆菌表达的重组sIL-4R

第五部分 重组sIL-4R致敏哮喘豚鼠的药效学研究

第六部分：建立IL-4R拮抗剂高通量筛选模型

结论

参考文献

白细胞介素-4受体(Interleukin 4 Receptor,IL-4R)的生物学功能与信号传导

一.白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)

二.白细胞介素4受体(IL-4R)

三.IL-4R激活的信号传导

四.IL-4R信号途径的调制

五.IL-4Rα链缺陷小鼠的研究

六.IL-4Rα链的同种异型现象

七.可溶性IL-4Rα的研究进展

八.可溶性受体产生方式

九.可溶性受体作用机制(图6)

十.sIL-4R在免疫调节中的作用及其临床应用

十一.可溶性IL-4R在哮喘治疗中的应用

参考文献

致谢

论文发表及专利