抗核小体抗体在系统性红斑狼疮中的诊断意义及表达特异性膜抗体的B细胞系的建立

摘要

本论文分为三个部分，第一部分是抗核小体抗体和儿童系统性红斑狼疮的相关性研究。系统性红斑狼疮(SLE)是一种全身性自身免疫病，本病的病理过程中伴有明显的B淋巴细胞的活化。患者血清中可出现多种自身抗体，并因此导致组织和器官的损伤。自身抗体包括：DNA，组蛋白，非组蛋白和核小体等。核小体是SLE的自身免疫原，是多种抗核抗体出现的根源。我们检测了52例SLE儿童的血清，其中18例抗核小体抗体(AnuA)阳性。27例疾病对照组中1例AnuA阳性，30例正常对照组AnuA均为阴性。AnuA在儿童SLE中的敏感性为34.6％，特异性为96.3％。抗dsDNA抗体、抗心磷脂抗体阴性的SLE患儿AnuA阳性率分别为33.3％和25％。因此AnuA对儿童SLE的诊断具有较高的特异性，有助于抗dsDNA抗体、抗心磷脂抗体阴性的儿童SLE的诊断。 第二部分是用EB病毒转化人外周血B淋巴细胞，从而建立自身免疫病细胞系。同SLE一样，重症肌无力(MG)也是自身免疫性疾病，MG主要累及神经肌肉接头处突触后膜上AchR，早期或晚期重症肌无力患者中85％-90％为AchR抗体阳性。本实验采用可向培养基中释放EB病毒颗粒的B95-8细胞上清转化人外周血B淋巴细胞，体外建立了SLE和MG两种自身免疫病的永生化淋巴母细胞系(LCL)。进一步，我们将转化后的B淋巴细胞用半固体培养基将细胞克隆化培养，以期筛选出可以表达膜自身抗体的B细胞系。但是，由于病理性B细胞在整个B细胞库中所占比例过少，同时又由于患者血样较难采集，无法对更多血样进行转化，因此，没有通过EB病毒转化的方法得到表达膜自身抗体的B细胞系。 在第三部分工作中，我们用实验性重症肌无力造模的大鼠和小鼠为B细胞来源，寻找表达膜自身抗体的B细胞。应用杂交瘤技术，我们建立了大鼠骨髓和脾细胞融合的杂交瘤细胞株以及小鼠脾融合的杂交瘤细胞株，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、流式细胞术、WesternBlotting、质谱分析等方法证明了杂交瘤细胞既可以分泌抗体又可以表达膜抗体，这种特性是在细胞与骨髓瘤细胞融合后获得的。因此利用杂交瘤技术，可以建立表达人自身抗体的细胞系，它们可作为靶细胞，为探索双特异性分子在治疗自身免疫病中的应用提供了细胞模型，为进一步研究自身免疫病的治疗提供一个新途径。

目录

摘要

英文缩略语

前言

第一部分：抗核小体抗体和儿童系统性红斑狼疮的相关性研究

一、实验材料

(一)细胞系

(二)血样标本

(三)主要试剂

(四)仪器设备

(五)溶液配制

二、实验方法

(一)蛋白质的SDS-PAGE梯度凝胶电泳

(二)核小体的制备

(三)兔抗人IgG的提纯

(四)辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG

(五)酶联免疫吸附实验(ELISA)检测患者和正常人血清

(六)统计方法

三、实验结果

(一)血清中抗核小体抗体的水平

(二)AnuA与其他用于诊断SLE的自身抗体敏感性和特异性的比较

(三)AnuA在其他抗体阴性的SLE患者中的阳性率

四、讨论

第二部分EB病毒转化人外周血B淋巴细胞法建立自身免疫病细胞系

一、实验材料

(一)血液标本

(二)主要试剂

(三)仪器设备

(四)溶液配制

二、实验方法

(一)EB病毒转化人外周血B淋巴细胞

(二)转化后的B淋巴细胞核型分析

(三)FITC标记纯化的核小体

(四)FACS法检测EB病毒转化后的B淋巴细胞膜表面IgG

(五)EB病毒转化人外周血B淋巴细胞克隆化培养

三、实验结果

(一)EB病毒转化人外周血B淋巴细胞

(二)转化后的B淋巴细胞核型分析结果

(三)FACS法检测转化后的B淋巴细胞膜表面标记

(四)FACS法检测转化后的B淋巴细胞膜Ig

(五)FACS法检测膜表面自身抗体的表达

(六)EB病毒转化人外周血B淋巴细胞克隆化培养

四、讨论

第三部分表达膜AchR抗体的小鼠和大鼠B细胞的建立

一、实验材料

(一)主要试剂

(二)溶液配制

(三)实验性MG动物模型的建立

二、实验方法

(一)杂交瘤细胞的获得

(二)细胞株生物学特性分析

(三)单克隆抗体的纯化

(四)FITC标记单克隆抗体

(五)FACS检测杂交瘤细胞膜表面IgG

(六)提纯分泌抗体与膜抗体

(七)ELISA及SDS-PAGE电泳

(八)CNBr-activated Sepharose 4B交连AchR

(九)靶蛋白的的免疫沉淀

(十)Western Blotting

(十一)质谱分析的样品处理

三、实验结果

(一)从EAMG大鼠/小鼠杂交瘤分离表达膜抗AchR抗体的细胞株

(二)其它杂交瘤细胞mIgG的表达

(三)骨髓瘤细胞mIg的表达

(四)分泌型抗体与膜抗体分子量大小的比较

(五)膜Ig是特异性抗AchR抗体的分析

(六)表达AchRAb的B细胞株的生物学特性分析

(七)冲击免疫后融合前杂交瘤脾细胞mIg和特异性膜抗体的表达

四、讨论

小结

参考文献

综述 抗核小体抗体在系统性红斑狼疮中的检测意义

附录

致谢