第一部分 应用生物发光显像技术研究血管生成抑制因子vasostatin的抗肿瘤生成作用;第二部分 hSelK的功能及硒代半胱氨酸的参入机制研究

摘要

很多研究表明实体瘤的发生、发展以及转移都与血管生成密切相关。利用血管生成抑制剂进行的肿瘤抗血管生成治疗为实体瘤的治疗提供了新的策略。一些血管生成抑制剂如endostatin、angiostatin、TNP-470等已被发现并被应用于研究肿瘤的治疗。Vasostatin是1998年Pike等从Epstein-Barrvirus免疫细胞株的培养上清液中分离纯化的一种血管生成抑制因子，经鉴定证实为多功能蛋白质calreticulin的N端结构域片段。Vasostatin在体外可抑制内皮细胞如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖；在裸鼠肿瘤形成试验中，vasostatin可明显减低人Burkitt淋巴瘤、人结肠癌和胰腺癌的生长，延长带MethA和LL/2c肿瘤小鼠的存活时间。 近些年来，基因治疗特别是肿瘤基因治疗发展很快。在对转染基因的定位和表达进行监测时，基因显像是最有效的方法。一些非侵入性的活体成像技术，如PET、SPECT、MRI、超声、CT、生物发光显像和荧光显像可用于活体动物进行基因表达显像。其中，生物发光显像(Bioluminescenceimaging，BLI)是利用萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase，FLuc)，在ATP、氧气的辅助下，与外源注入的特异底物反应产生荧光，使用高度灵敏的CCD相机可观测并纪录发出的光子，进行显像。 将报告基因与所感兴趣的治疗基因偶联，通过对报告基因显像可以间接监测治疗基因的表达。本研究采用融合表达方案，将治疗基因(vasostatin)和报告基因(fluc)偶联构建融合表达载体，通过生物发光显像技术对报告基因fluc显像来监测治疗基因vasostatin的抗肿瘤生成作用。为使表达的融合蛋白中两个蛋白互相不干扰，并有天然的特性，我们在治疗基因vasostatin和报告基因fluc之间加入了四种不同长度的柔性短肽，其氨基酸序列为(GGGGS)n。然后在293ET和PC3细胞中验证了四种融合重组质粒的荧光素酶活性。其中，含柔性肽段(GGGGS)2的融合表达重组质粒(v10fl)荧光素酶活性最佳。 筛选稳定表达V10FL融合蛋白和阳性对照Fluc的PC3细胞后，用生物发光显像技术进行了体外显像。结果显示，阳性对照FLuc能检测到的最少细胞数为300～700/孔，而V10FL融合蛋白为1500～3000/孔。两种稳定细胞系中，每孔发出的光子数与细胞数的相关性均很好(r2分别为0.98和0.97)。用稳定表达Fluc的PC3细胞构建荷瘤模型，用生物发光显像能检测到肿瘤的发生，随着瘤体的增大，生物发光信号也逐渐增强。 随后，用前列腺癌细胞系PC3和血管内皮细胞系HUVEC研究了vasostatin的体外活性。用腺病毒载体携带治疗基因vasostatin，感染PC3细胞后，通过RT-PCR能够检测vasostatinmRNA表达的增加，Westernblot分析也能在培养上清液中检测到vasostatin蛋白的分泌。用Ad-vasostatin感染HUVEC和PC3细胞，Ad-vasostatin能够明显抑制HUVEC的增殖，而对PC3没有明显影响。 硒是哺乳动物必需的一种微量营养元素，其生物学功能主要以硒蛋白的形式表现。硒蛋白的特征是蛋白中含有硒代半胱氨酸(Sec)，硒代半胱氨酸为第21种氨基酸，由通常情况下作为终止密码子的UGA编码。真核生物硒蛋白的生物合成过程中，硒代半胱氨酸的参入需要3’非编码区(3'UTR)的硒代半胱氨酸插入元件(SECIS)，SECIS结合蛋白SBP2等。目前为止，共鉴定出约25种人硒蛋白基因。人硒蛋白K(hSelK)是新发现的一种编码硒蛋白的基因，目前它的生物学功能和硒代半胱氨酸的参入机制尚不清楚。用同位素参入实验证实了hSelK硒代半胱氨酸的参入需要hSelKmRNA的3'UTR。然后，利用RNA凝胶电泳迁移实验和SECIS元件突变实验证实了SBP2能和hSelK3'UTR的SECIS元件相互作用，SBP2能特异性结合hSelKSECIS元件的非Watson-CrickG-A/A-G四联体碱基对。为了探寻hSelK的功能信息，用Northern杂交技术分析了hSelKmRNA的组织表达谱，结果显示hSelK在心脏高表达。用激光共聚焦显微镜观察到hSelK与内质网呈现共定位。利用重组腺病毒Ad-SelK感染原代培养的心肌细胞，发现过表达hSelK能降低原代心肌细胞内的ROS水平，能保护细胞免受H2O2引起的氧化损伤和星型孢菌素引起的细胞调亡。目前的结果提示，hSelK可能调节细胞的氧化还原平衡，具有心肌细胞保护作用。

目录

第一部分应用生物发光显像技术研究血管生成抑制因子vasostatin的抗肿瘤生成作用

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

第二部分hSelK的功能及硒代半胱氨酸的参入机制研究

前言

实验结果

讨论

小结

参考文献

论文综述 分子显像的研究进展和发展前景

附录一英、汉名词对照

发表文章及会议摘要

致谢