双链腺相关病毒载体构建及单链腺相关病毒介导外源性血管生成素-1基因治疗大鼠脑缺血的疗效评价

摘要

研究背景和目的
　　 基因治疗缺血性脑卒中，值得探索。基因导入系统的选择，即载体选择，至关重要。目前，腺相关病毒载体（adeno-associated vires，AAV）在缺血性脑卒中基因治疗中应用广泛。
　　 通常所用的单链AAV2载体，虽然具有安全性好、免疫原性低、表达时间长等优点，但其一个显而易见的缺点是表达延迟，而且有表达水平低的现象。这是因为单链AAV2载体进入细胞后，需要有一个由单链转变为双链的过程，然后才能表达，故此需要一定时间才能检测到基因的表达。此外，这种向双链的转变受很多因素的影响，有些AAV2基因组不能转变成双链，因此表达水平虽然逐渐上升，但最高的表达水平仍较低。
　　 研制双链AAV2载体（double-stranded adeno-associated virus，dsAAV2），有望促使目的基因更快更高表达。dsAAV2载体进入细胞后，不需要一个由单链变为双链的过程，可以直接表达，而且表达水平相对较高。因此，dsAAV2非常适合应用在要求快速表达目的基因并且需要较高表达水平的基因治疗方案中。
　　 缺血性脑血管疾病的基因治疗，选择dsAAV2载体有助于目的基因快速、持续、较高表达。同时，缺血性脑血管疾病的基因治疗，选择更多更好的目的基因，也至关重要。
　　 多年来，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）一直是缺血性脑卒中实验研究中应用最多的促血管生成因子之一。然而，近年研究明确表明VEGF在急性脑缺血的早期血管内应用可以增加血脑屏障（blood brainbarrier，BBB）的破坏，增加微血管的渗出，诱发严重的脑水肿，甚至形成缺血灶内血肿。
　　 为了在脑缺血早期发挥VEGF最大限度的治疗作用，避免其作为通透性因子诱发脑水肿的副作用，血管生成素（Angiopoietin-1，Ang-1）和VEGF联合应用值得探索尝试。这是因为近来研究表明，Ang-1可以对抗VEGF所引发的血管渗透性增加，抑制单层血管内皮细胞的通透性，防止微血管渗漏，参与维持成熟血管的完整性。
　　 选择合适的载体及目的基因，二者兼顾，这对于缺血性脑血管疾病的基因治疗大有裨益。因此，本研究尝试：1）研制双链腺相关病毒载体（dsAAV2），探索dsAAV2-EGFP的构建；2）进行rAAV1载体介导外源性Ang-1和VEGF-165基因治疗大鼠脑缺血的疗效评价。
　　 研究内容、方法及结果
　　 Part1 pSC-CMV-EGFP质粒构建
　　 主要步骤包括目的基因pSNAV2.0-EGFP及pSC-CMV-lacZ alpha载体片段的酶切；目的基因片段及载体质粒片段的回收、连接构建；重组质粒pSC-CMV-EGFP的酶切鉴定；测序鉴定等。鉴定结果成功构建质粒pSC-CMV-EGFP。
　　 Part2 dsAAV-EGFP病毒载体构建
　　 主要步骤包括质粒pSC-CMV-EGFP大量提取、大提质粒浓度及酶切鉴定、293T细胞准备、三质粒共转染、病毒纯化及病毒检测等。
　　 其中病毒检测，采用BCA法测定产品蛋白浓度，Southern blot、Real-timePCR法检测基因组滴度，SDS-PAGE检测病毒纯度，PCR法鉴定目的基因EGFP等。
　　 转染BHK-21细胞、293细胞，进行EGFP活性检测及单双链AAV活性对比，dsAAV2/1-EGFP可使293细胞、BHK-21细胞更早表达EGFP。
　　 鉴定结果：成功构建dsAAV-EGFP。
　　 Part3 pSC-CMV-VEGF质粒构建
　　 主要步骤包括设计引物；对原始质粒pRRLSIN-VEGF165-EGFP进行PCR，PCR产物行电泳，切胶回收，用KpnI和SalI双酶切，产物行电泳，切胶回收；用KpnI和SalI双酶切中间载体pSC-CMV-LacZ alpha，回收大片段；将上述产物连接转化，得到pSC-CMV-VEGFl65质粒。取构建引物行PCR鉴定、KpnI和Sall双酶切鉴定并测序。鉴定结果：成功构建pSC-CMV-VEGFl65。
　　 Part4 rAAV1-Angl/rAAV1-VEGF165基因治疗大鼠脑缺血疗效评价
　　 采用脑立体定向输注的方法，将rAAV1-VEGF治疗载体或者rAAV1-VEGF/rAAV1-Angl的混合治疗载体通过侧脑室转染途径对大鼠大脑中动脉阻塞缺血再灌注模型（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）进行基因治疗，以观察其在脑缺血再灌注损伤中的治疗作用和可能的机制。
　　 对rAAV1-VEGF165/rAAV1-Angl混合转染后在脑内的表达情况、BBB的通透性、缺血周围区微血管的密度、BBB功能性蛋白因子表达等项目进行检测。结果表明，利用rAAV-VEGF165/rAAV-Angl双基因治疗与rAAV-VEGF165单基因治疗相比，可以明显减轻脑缺血后BBB渗出，促进缺血灶周围区血管密度的显著增加，增加脑保护蛋白c-fos、occludin的生成表达，减少与脑水肿密切相关的4型水通道蛋白的表达。
　　 结论
　　 1通过三质粒共转染方法，采用Southern blot、SDS-PAGE等检测证实，成功构建dsAAV2/1-EGFP病毒载体。
　　 2与rAAV2/1-EGFP相比，dsAAV2/1-EGFP可使293细胞、BHK-21细胞更早表达EGFP。
　　 3经凝胶电泳、PCR测序检测证实，成功构建质粒pSC-CMV-VEGF。
　　 4与rAAV-VEGF单基因治疗相比，rAAV-VEGF/rAAV-Angl双基因联合治疗脑缺血能够协同促进有功能的微血管增生，抑制BBB渗出，协同发挥神经保护作用。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

前 言

参考文献

第一部分：pSC-CMV-EGFP质粒构建

材料与方法

实验结果

第二部分：dsAAVl-EGFP病毒载体构建

材料与方法

实验结果

第三部分：pSC-CMV-VEGF165质粒构建

材料与方法

实验结果

第四部分：rAAVl载体介导外源性VEGF-165和Angiopoietin-1基因治疗大鼠脑缺血的疗效评价及其机制研究

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

实验图片

参考文献

本研究创新点

本研究的不足之处

综述一：应用腺相关病毒载体系统基因治疗缺血性脑卒中的研究进展

参考文献

综述二：Angiopoietin 1在缺血性脑卒中实验研究中的应用

参考文献

致谢

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