新型化合物FLZ对热休克蛋白的诱导作用和对实验性帕金森氏病模型多巴胺系统保护作用及机制的研究

摘要

帕金森氏病(Parkinson's disease,PD)是一种与年龄相关的神经系统退行性疾病,其发病率仅次于老年痴呆(Alzheimer’disease,AD),是第二常见的神经退行性疾病。PD的主要病理特征为患者黑质致密部的多巴胺神经元选择性丢失,以及细胞质内路易式小体(Lewy body,LB)的形成,这些病理变化最终导致黑质纹状体多巴胺神经功能低下而胆碱能神经功能相对占优势,从而产生运动障碍。PD的主要临床症状是静止性震颤、僵直、反应迟钝、身体姿势和运动平衡失调等。
　　 PD的发病机制十分复杂,目前还不十分清楚。一般认为基因和环境因素共同导致了PD。与PD相关的发病机制包括线粒体功能障碍、氧化应激、蛋白质的错误折叠和聚集以及炎症。目前,对于PD的治疗都只能改善症状,不能延缓疾病的进展,因此,迫切需要开发既能改善症状又能延缓疾病进程的药物。
　　 FLZ是一个新型的番荔枝酰胺衍生物,前期研究证实具有很强的神经保护作用,可以改善实验性AD和实验性PD动物的行为学障碍,同时在体外对多种损伤剂引起的神经元凋亡具有明显的保护作用,是一个很有开发前景的新型化合物。本研究采用SH-SY5Y细胞株、PD大鼠模型和MN9D细胞株对FLZ的神经保护作用及作用机制进行研究。本论文分为以下三个部分:
　　 第一部分:新型化合物FLZ对SH-SY5Y细胞热休克蛋白的诱导作用及其在MPP+引起的神经细胞损伤中的保护作用
　　 热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)是一种重要的分子伴侣,在神经退行性疾病中具有重要的保护作用,上调细胞中热休克蛋白的水平是一种极富前景的治疗蛋白质错误折叠和聚集导致的神经退行性疾病的策略。前期研究表明,FLZ在多种实验性PD模型中均具有较好的保护作用,但FLZ的神经保护机制尚不十分明确。本实验主要研究FLZ对热休克蛋白的诱导作用及其在抗神经细胞凋亡中的作用。结果表明,FLZ可以时间和剂量依赖性的诱导SH-SY5Y细胞中HSP27和HSP70蛋白和mRNA表达。进一步研究表明FLZ可以激活热休克因子(HSF1),促进其入核和磷酸化,FLZ还可激活HSF1调节激酶Akt,增加其磷酸化水平。当用PI3K抑制剂LY294002抑制Akt活性后,FLZ诱导的HSF-1的活化及HSP27和HSP70表达也同时被抑制,表明FLZ对热休克蛋白的诱导作用与其激活Akt有关。此外,热休克蛋白生成抑制剂槲皮素(Quercetin)可抑制FLZ诱导的HSF1活化及HSP27和HSP70的表达。在此基础上,采用MPP+损伤的SH-SY5Y细胞评价了HSP27和HSP70在FLZ神经保护中的作用。结果显示,提前给予FLZ可以显著诱导HSP27和HSP70的表达,DAPI染色和流式检测结果表明FLZ可明显抑制MPP+引起的SH-SY5Y细胞凋亡,同时给予槲皮素后,FLZ对MPP+损伤的细胞保护作用显著降低,表明FLZ诱导的HSP27和HSP70在其神经细胞保护作用中发挥了一定的调节作用。这些结果为阐明FLZ的神经保护作用机制提供了新的解释。
　　 第二部分:新型化合物FLZ对6-OHDA诱发的PD大鼠模型的保护作用及机制研究
　　 本研究主要考察FLZ对6-OHDA诱发的大鼠PD模型多巴胺能神经系统的影响。采用大鼠黑质内立体定位注射6-OHDA建立PD模型,2W后筛选模型成功的大鼠进行实验。大鼠灌胃FLZ20 mg/kg,35 mg/kg和50mg/kg,每天一次,连续4W,每2 W检测一次行为学。末次给药后断头取脑,用于免疫组化检测黑质和纹状体酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数量、免疫印迹、HPLC分析和免疫共沉淀等研究。结果显示FLZ能明显抑制黑质多巴胺能神经元的凋亡,提高纹状体内多巴胺(DA)的水平,从而改善阿扑吗啡诱导的大鼠旋转行为。对其机制研究发现6-OHDA能引起DA合成限速酶TH及其活性形式磷酸化的酪氨酸羟化酶(p-TH)表达的降低,FLZ可明显提高TH和p-TH的表达。FLZ对DA的主要代谢酶MAO-B的活性无明显影响。表明FLZ提高DA的水平作用主要是通过提高TH的表达而实现的。此外,研究发现FLZ也可明显抑制由6-OHDA引起的α-synuclein、caspase-3和RTP801蛋白表达的升高及p-Akt表达的降低。以上研究结果表明FLZ能活化Akt,抑制凋亡相关蛋白caspase-3和RTP801,从而促进多巴胺能神经元的存活,并因此提高了TH的表达。此外,FLZ还可以抑制α-synuclein与TH的结合从而促进TH的磷酸化并因此提高DA的水平,发挥其抗帕金森病的作用。
　　 第三部分:FLZ对MPP+和6-OHDA损伤的MN9D细胞多巴胺系统的保护作用及机制研究
　　 本部分研究旨在进一步证实FLZ对多巴胺系统的保护作用并对其机制进行探讨。采用MPP+和6-OHDA损伤MN9D细胞考察FLZ的保护作用及其可能的作用机制。研究结果显示,FLZ对MPP+和6-OHDA损伤MN9D细胞具有明显的保护作用,对MPP+和6-OHDA引起的MN9D细胞内DA含量降低有一定的抑制作用。深入研究发现FLZ可以抑制由MPP+和6-OHDA引起的MN9D细胞内p-TH表达的降低,对MAO-B的活性无明显影响。FLZ还可明显抑制由MPP+和6-OHDA引起的RTP801蛋白表达的升高及p-Akt表达的降低。FLZ还抑制6-OHDA引起的α-synuclein表达的升高,并抑制α-synuclein与TH的结合促进14-3—3ζ与TH的结合。此外,当用LY294002抑制FLZ对Akt的激活后,FLZ对6-OFIDA损伤MN9D细胞的保护作用减弱,提示Akt信号通路在FLZ治疗PD中发挥了一定的调节作用。
　　 结论:
　　 1.FLZ是一种新型的HSP27和HSP70诱导剂,HSP27和HSP70在FLZ的神经保护作用中具有一定的调节作用。
　　 2.FLZ治疗PD与其降低6-OHDA引起的α-synuclein的表达,抑制α-synuclein与TH的结合促进14-3-3ζ与TH的结合从而促进TH的磷酸化,增加多巴胺的合成有关。
　　 3.FLZ可抑制凋亡相关蛋白caspase-3和RTP801的表达,促进Akt的活化从而抑制神经细胞凋亡,进而实现其治疗PD的作用。另外,Akt的活化在FLZ对PD的保护作用也发挥了一定的调节作用。