肠道病毒71型类病毒颗粒在昆虫细胞Sf9中的表达

摘要

肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)是手足口病(Hand,Foot,and MouthDisease,HFMD)最重要的病原体。对于手足口病目前尚无有效治疗的药物,疫苗将成为预防EV71感染最有效的手段之一。用疫苗预防传染性疾病包括传统技术制备的减毒活疫苗和灭活疫苗,以及现代生物技术研制的新型疫苗。类病毒颗粒(VirusLike Particle,VLP)疫苗是新型疫苗中基因工程亚单位疫苗免疫原性最理想的一种形式。类病毒颗粒是由病毒外壳蛋白质所组成的不含遗传物质的壳状结构。由于其内部没有核酸,自身不具备复制性,所以作为疫苗安全性高,同时类病毒颗粒具有相对较完整的病毒结构,故其免疫原性强,这些优点使类病毒颗粒疫苗成为基因工程疫苗研究的热点。
　　 重组杆状病毒是一个很有前景的外源基因表达系统,能高效表达抗原性、免疫原性和生物活性较好的蛋白质,并能形成VLP。研制VLP除了有效的表达系统以外,还需要选择合适的抗原基因。EV71主要的抗原基因P1在未加工时免疫原性有限,当被蛋白酶3CD切割成病毒衣壳蛋白暴露在病毒表面后,免疫原性得到提高。
　　 基于以上原理及设想,本研究构建了含有EV71的P1基因和3CD基因的嵌合型重组质粒pFastBac Dual-P1-3CD,然后转化DH10感受态细胞,经同源重组得到重组杆状病毒质粒Bac-P1-3CD。将Bac-P1-3CD转染Sf9昆虫细胞以获得重组杆状病毒,收获感染重组杆状病毒的Sf9细胞,用SDS-PAGE,Western blot和电镜对基因表达产物进行检测和分析,评价了P1和3CD基因在昆虫细胞中表达,以及3CD蛋白酶对P1蛋白的切割作用,以及切割后病毒蛋白成分的抗原性。
　　 实验结果表明,经同源重组获得了在Sf9细胞中包装的重组杆状病毒；表达产物用SDS-PAGE检测到39kDa、32kDa、26kDa,三条特异蛋白条带,与EV71 VP1、VP0、VP3蛋白大小相近,提示重组杆状病毒表达了P1蛋白和3CD蛋白酶,并且3CD蛋白酶切割了P1蛋白；Western blot检测到能与抗EV71血清反应的特异性条带,与EV71 VP1大小相近,证明表达产物为EV71特异性抗原；电镜下观察到形态学典型的EV71类病毒颗粒。这项研究证实了EV71 P1和3CD基因可以以嵌合形式通过重组杆状病毒在昆虫细胞中共表达,3CD蛋白酶可以切割P1蛋白得到VP1抗原成分,并能形成类病毒颗粒。这些研究结果不仅对研制EV71类病毒颗粒疫苗具有重要意义,也对研究小RNA病毒结构蛋白与非结构蛋白的相互作用提供了理论依据与技术手段。