超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的磁共振活体示踪的动态量化研究

摘要

本研究使用超顺磁性氧化铁(Superparamagnetic lron Oxide，SPIO)纳米颗粒对大鼠的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)进行体外标记，采用7.0T小动物专用超导磁共振成像系统对SPIO标记的MSCs进行其注射入心肌梗死大鼠模型心肌后的活体示踪观察，探讨7.0T超导磁共振成像仪对SPIO标记BMSCs进行活体长期动态观察的可行性。本研究分为两个部分。
　　 第一部分大鼠心肌梗死模型的建立及超高场强(7.0T)小动物磁共振心脏电影成像研究
　　 [目的]
　　 探索稳定的结扎冠状动脉制作大鼠心肌梗死模型的方法以及使用超高场强(7．0T)小动物磁共振成像系统的心脏cine电影成像序列评估大鼠心脏功能的可行性。
　　 [方法]
　　 15只雌性Lewis大鼠开胸结扎冠状动脉前降支制作心肌梗死模型，分别于手术前及术后2周使用超高场强(7.0T)小动物磁共振成像系统的心脏cine电影成像序列测定心功能，术后2周磁共振检测结束后处死动物行病理组织学检测，以HE染色观察心肌坏死及纤维化情况。
　　 [结果]
　　 通过开胸结扎冠状动脉前降支制作大鼠心肌梗死模型的成功率66.7％，死亡率33.3%，术中可见前降支结扎后结扎线以下及心尖部心肌组织变苍白或瘀紫。术前及术后2周行磁共振心脏cine电影成像序列扫描，发现心梗模型大鼠左心室前壁及心尖部室壁明显变薄，运动减弱或消失，室壁瘤形成。手术后2w心功能较术前显著降低（射血分数：56.45±7.46 vs79.84±9.34，P＜0.05），左室舒张末期容积、收缩末期容积均有增加（3.43±0.39 vs3.02±0.32，P＜0.05;1.54±0.33 vs1.29±0.23，P＜0.05），心肌质量亦减小（3.25±0.43 vs3.45±0.33），但无统计学意义(P＞0.05)。磁共振成像结果经组织切片HE染色证实为心肌组织梗死。
　　 [结论]
　　 通过开胸结扎冠状动脉前降支可以获得符合实验要求的大鼠心肌梗死模型。术中局部心肌改变可作为初步判断大鼠心肌梗死模型造模是否成功的指标。磁共振心脏cine电影成像序列扫描可用于大鼠心梗模型心功能参数的评估。
　　 第二部分：
　　 超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞活体心肌移植的磁共振成像研究
　　 [目的]
　　 研究心梗模型大鼠同种异体骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对心功能的影响，并探讨利用7.0T磁共振成像系统活体示踪SPIO标记的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)心肌移植的可行性及准确性。
　　 [方法]
　　 采用全骨髓细胞直接贴壁法分离培养雄性Lewis大鼠MSCs，移植前行SPIO及DAPI标记，采用开胸结扎冠脉前降支的方法制备雌性Lewis大鼠急性心肌梗死模型，心梗后2w行磁共振检测筛选合格动物模型随机分为2组，并测定基线数据，随后再次开胸经心外膜分别注射106浓度MSCs(MSCs移植组)和等体积的磷酸盐缓冲液（对照组），所有动物分别于移植后3天、1w、2w、4w行磁共振系列扫描，观察移植前后心功能的变化情况并活体追踪观察移植细胞的信号变化。之后两组每次各取5只动物进行磁共振扫描，然后取材进行组织学及分子生物学检测，包括HE、普鲁士蓝染色、TUNEL细胞凋亡检测、巨噬细胞免疫组化及Realtime RT-PCR SRY基因表达检测，分别观察移植后SPIO与MSCs及巨噬细胞在体内的分布以及雄性大鼠来源的MSCs存活情况。
　　 [结果]
　　 通过开胸心肌直接注射方式植入的标记细胞可通过磁共振成像在体检测到低信号影像，并可持续至移植后4周，但局部信号强度逐渐增高，信号减低程度减小，低信号区面积逐渐减小，边界变模糊，对照组始终未检测到低信号。MSCs注射后1周与3天时注射点T2*低信号区的信号强度、信号减低程度及面积之间均无统计学差异（257.05±56.43 vs227.56±87.62;79.74±4.41 vs85.27±6.04;4.98±0.22 vs5.34±0.45）。而MSCs移植后2周、4周时的注射点T2a*低信号区的信号强度明显增高(554.76±95.25 vs227.56±87.62，P＜0.05;798.74±121.89 vs227.56±87.62，P＜0.05)，信号减低程度减弱(67.14±2.67vs85.27±6.04，P＜0.05；59.73±3.58 vs85.27±6.04，P＜0.05)，低信号区面积亦较前减小(2.43±0.34vs5.34±0.45，P＜0.05;1.62±0.23vs5.34±;0.45，P＜0.05)。磁共振心功能分析显示，同种异体MSCs移植后3d、1w、2w时与基线及对照组相比，左室射血分数略有提高(53.27±9.44 vs51.42±7.41，P＞0.05;55.57±12.52 vs51.42±7.41,P＞0.05;54.43±10.99 vs51.42±7.41,P＞0.05;53.27±9.44 vs49.67±7.03，P＞0.05;55.57±12.52 vs47.66±6.76，P＞0.05;54.43±10.99 vs48.30±8.61，P＞0.05)，左室收缩末期容积缩小（1.37±0.57vs1.46±0.33，P＞0.05；1.29±0.66vs1.46±0.33,P＞0.05;1.33±0.58 vs1.46±0.33,P＞0.05;1.37±0.57 vs1.51±0.38,P＞0.05;1.29±0.66 vs1.39±0.11，P＞0.05;1.33±0.58 vs1.49±0.30，P＞0.05），但两项指标改善均无统计学意义。而对照组于移植后2w、4w时的舒张末期容积相比基线时增加(3.65±0.50 vs3.19±0.35;3.59±0.36 vs3.19±0.35，P＜0.05)。TUNEL细胞凋亡检测显示植入心肌内的MSCs随时间推移逐渐凋亡至消失，Realtime RT-PCR SRY基因表达检测结果显示细胞移植术后3天、1周、2周、4周时心肌内SRY基因的表达量逐渐减少（8.70±0.97&5.35±0.63＆1.63±0.07&0.59±0.03）,4周后几乎无MSCs存活，与组织切片的TUNEL细胞凋亡检测结果一致。对照组无SRY基因的表达。组织切片普鲁士蓝染色及免疫组织化学检测显示标记的SPIO随细胞植入时间的推移逐渐被巨噬细胞吞噬，细胞移植2、4w后其在心肌内的分布与巨噬细胞的分布一致。
　　 [结论]
　　 大鼠心梗模型同种异体骨髓间充质干细胞移植能够轻度改善心功能。磁共振成像可应用于干细胞研究的确切疗效评价。虽然MRI可以检测SPIO在体内产生的低信号影，但无法准确在体示踪标记的移植细胞的分布、迁移及存活情况。