人-鼠嵌合型抗弓形虫IgM抗体检测质控物研制和基于病毒样颗粒的microRNA-146a转运方法建立及其在系统性红斑狼疮中的治疗研究

摘要

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种世界性分布的专性细胞内寄生原虫，能感染人和动物，引发人畜共患性弓形虫病。我国人群弓形虫感染率约为5～20％，成年人多为隐性感染，但孕早期弓形虫感染可引起胎儿畸形、多器官坏死等严重损害。因此弓形虫是孕产妇ToRCH（弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ型）筛查的检测项目之一。目前国内应用最广泛的弓形虫感染检测方法是特异性IgG、IgM酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，尤其是特异性IgM抗体的检测有助于确定感染发生的时间，判断感染的性质，预测感染的可能危害。为了保证检测结果的准确可靠，临床实验室需要阳性质控物进行室内质量控制，质评机构亦需要质控物开展相应项目的室间质量评价。通常用于弓形虫IgM检测的质控物为感染者的血清或血浆与正常血清或血浆的混合物，其最大的缺陷是来源极其有限。另外还有价格昂贵、存在IgM抗体特异性和亲和力的批间差异、可能存在医学伦理问题及有潜在的传染危险性等缺点。因此在第一部分中我们使用基因工程嵌合抗体技术制备了可以替代传统含抗弓形虫IgM的血清，用于ELISA检测质控物的人-鼠嵌合型抗弓形虫IgM抗体，并对其作为质控物的稳定性、通用性等特点进行了评价。结果显示本研究制备的人-鼠嵌合型抗弓形虫IgM抗体具有以下特点:①稳定性良好，37℃和室温条件保存一个月，或4℃和-20℃保存两个月不会出现抗体效价的明显变化，满足作为临床实验室抗体检测质控物稳定保存较长时间的要求;②具备较好的通用性，可被目前主要抗弓形虫IgM ELISA试剂盒检出;③通过基因工程嵌合抗体技术真核表达得到，没有生物传染危险性;④制备方法简便易行，成熟廉价，可大量制备;⑤不涉及获取病人阳性样本时可能遇到的伦理问题，克服了传统的血清来源阳性质控物在这些方面的缺陷。因此本研究建立的方法不仅基本解决了抗弓形虫IgM ELISA检测质控物的制备问题，也为其他病原体特异性IgM、IgG质控物的研制提供了有价值的参考依据。
　　 系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一种多器官、多系统受损的慢性系统性自身免疫性疾病。目前SLE的确切发病机制仍未完全阐明，患者突出表现为体内存在多种免疫功能异常，如T细胞数量和功能减低、B细胞过度活化增殖、产生多种自身抗体而引发持续的自身反应性炎症，最终出现肾脏、中枢神经系统损害，甚至死亡。MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类大小约为20～25个核苷酸的具有调控功能的内源性非编码RNA。成熟的miRNAs可与靶mRNA3'端非翻译区位点特异性结合，根据互补程度的不同降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译，发挥转录后水平基因调控作用。miRNAs参与生命过程中的一系列重要进程，如病毒防御、造血分化、器官形成、细胞增殖和凋亡等，并已探索性的进入治疗领域。但目前应用miRNAs进行疾病治疗面临的瓶颈之一是其属于核糖核苷酸类分子，裸露的核酸分子在体内环境中极易被各种核酸酶降解并且很难被细胞摄取。因此miRNAs治疗性研究能否获得理想效果的关键取决于有无高效可靠的miRNAs递送途径。在第二部分的研究中，我们以MS2噬菌体病毒样颗粒包裹miR-146a前体，将其与HIV-1 Tat47-57穿透肽交联，建立一种新型的以病毒样颗粒为基础的具有自主转导能力的miRNAs转运方法。随后我们对该方法递送的miR-146a在系统性红斑狼疮小鼠中的治疗作用进行了探讨。体外细胞和体内实验证实，使用该转运方法处理可使miR-146a水平在细胞中升高4～5倍，并稳定持续约120小时，优于对照组使用的常规脂质体转染方法;体内实验中可诱导miR-146a过表达两倍左右，最大miR-146a浓度的半衰期约为43小时。该方法制备简单，产物稳定，细胞摄取率高、细胞毒性低。在治疗性研究方面，使用该病毒样颗粒4次注射后，狼疮小鼠血清抗dsDNA抗体、ANA和总IgG抗体水平显著下降，SLE相关炎症细胞因子表达降低，SLE相关Toll样受体通路中的白细胞介素1受体相关激酶-1、TNF受体相关因子-6和NF-κB分子表达活化受到明显抑制。本研究的创新在于:①建立了基于MS2 VLPs的miR-146a转运方法，该方法可高效、稳定、低毒、灵活的将包括miR-146a在内的多种miRNAs递送到细胞内实现高表达，丰富了RNA干扰的技术手段，部分解决了目前存在的技术瓶颈。②首次将miRNAs引入SLE治疗领域，过表达的miR-146a通过TLR通路抑制了狼疮小鼠体内自身抗体的产生，初步实现了SLE治疗作用，为进一步研究和应用拓展奠定了基础。弓形

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英文缩略词

摘要

第一部分 人-鼠嵌合型抗弓形虫IgM抗体检测质控物研制

前言

1．材料和方法

1．1．实验材料和试剂配制

1．2．方法

2．结果

2．1．人-鼠嵌合抗弓形虫IgM抗体表达质粒的构建

2．2．人-鼠嵌合抗弓形虫IgM抗体的表达与鉴定

2．3．人-鼠嵌合抗弓形虫IgM抗体作为质控品的应用研究

3．讨论

第二部分 基于病毒样颗粒的microRNA转运方法建立及其在系统性红斑狼疮中的治疗研究

前言

1．材料和方法

1．1．实验材料和试剂配制

1．2．方法

2．结果

2．1．重组病毒样颗粒的表达和纯化

2．2．重组病毒样颗粒的鉴定

2．3．重组病毒样颗粒与Tat47-57穿透肽的交联鉴定

2．4．FITC标记的交联重组病毒样颗粒转入细胞后检测

2．5．重组病毒样颗粒介导的miR-146a过表达体外有效性验证

2．6．重组病毒样颗粒介导的miR-146a过表达体内有效性验证

2．7．重组病毒样颗粒对系统性红斑狼疮小鼠的治疗作用研究

3．讨论

参考文献

论文综述 人源化抗体制备技术研究进展

附录1 pcDNA3．0载体详细信息

附录2 鼠抗弓形虫P30抗原轻、重链可变区序列

附录3 重组表达载体pcDNA3-κchain和pcDNA3-μchain测序结果

附录4 己发表治疗性miRNAs研究使用的转运递送系统文献分析

附录5 pACYC-Duet1载体详细信息

附录6 pmirGLO载体详细信息

附录7 pMS-miR146a和pMS-miRNC表达质粒全基因合成测序结果

致谢

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