第一部分 异基因造血干细胞移植后CD4+T细胞免疫重建特征及与侵袭性真菌感染关系的研究;第二部分 异基因造血干细胞移植后肠道急性移植物抗宿主病危险因素分析

摘要

第一部分异基因造血干细胞移植后CD4+T细胞免疫重建特征及与侵袭性真菌感染关系的研究 研究背景:异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)后存在免疫重建(immune reconstitution，IR)延迟，尤其CD4+辅助T细胞(T helper cells，Th)重建缓慢，是移植后感染、复发、继发肿瘤等疾病的重要原因[1]。侵袭性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)是移植后患者死亡的重要原因之一。目前研究表明CD4+辅助T细胞中几个主要亚群T17细胞(T helper17)、Th1细胞(T helper1)、Th2细胞(T helper2)、调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)在机体对真菌感染的免疫应答中发挥不同作用，T17、Th1细胞主要发挥抗真菌作用，而Th2、Treg则在机体抗真菌免疫中发挥免疫抑制作用，不利于感染的控制。在异造血干细胞移植后这些CD4+T细胞亚群的重建特征目前研究较少，它们在移植后IFI的发生中是否发挥作用，目前未见报道。 目的:研究异基因造血干细胞移植后3个月内CD4+T细胞及其各个亚群的免疫重建特征;观察各个亚群与IFI的关系，探讨它们在IFI中的作用。 方法:收集我院干细胞移植中心自2013年7月至2014年3月进行allo-HSCT后14天、1个月、2个月、3个月检测的62例患者152次的外周血标本，以26名供者作为健康对照组(healthy controls，HC)。应用流式细胞术检测CD4+T细胞各个亚群T17、Th1、Th2、Treg的比例，应用实时定量PCR(real time PCR，RT-PCR)方法检测Th17、Th1、Th2、Treg的特异转录因子维甲酸相关孤儿核受体(retinoicacid-related orphan receptorγt，RORγt）、T-bet(T box expressed in T cells)、转录因子GATA结合蛋白-3(GATA binding protein-3，GATA3)、叉状头/翅膀状螺旋转录因子(forkhead/winged helix transcription factor P3，FoxP3)的mRNA表达量，应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测Th1类细胞因子干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、Th2类细胞因子白介素6(interleukin6，IL-6)、白介素10(interleukin10，IL-10)、Treg分泌的细胞因子转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）血浆浓度的变化。首先分析影响移植后淋巴细胞亚群重建的影响因素，据此对组内患者进一步分亚组。通过比较移植后1、2、3月份患者各个指标与健康对照组的差别、不同月份间CD4+T细胞各个亚群相关指标的动态变化，观察其免疫重建特征。应用Logistic回归分析观察CD4+T细胞亚群与IFI的关系，探讨其在IFI发生中的作用。 结果:1、移植后免疫重建的影响因素的研究移植后1个月CD3+细胞数与受者年龄与有关（β=-0.308，P=0.039）。移植后1个月CD4+T细胞数与既往有无急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease，aGVHD)(β=-0.355，P=0.017)、供者类型（β=-0.427，P=0.046）、受者年龄（β=-0.365，P=0.009）有关。移植后2个月CD3+细胞数与预处理是否含抗胸腺细胞球蛋白(antithymocyte globulin，ATG)(β=-0.387,P=0.021)有关。移植后3个月CD4+T细胞数与预处理是否应用ATG(β=-0.387，P=0.043)有关。 2、移植后不同月份患者各个指标与健康对照组的比较(1) CD3+细胞数在移植后1月患者[(559.93±323.27)×106/L，P=0.000]低于健康对照组[(1311.55±363.68)×106/L]，在移植后2月未应用ATG预处理组[(1463.62±900.71)×106/L]与健康对照组[(1311.55±363.68)×106/L]无差别(P=0.661)，而应用ATG预处理组[(798.33±602.58)×106/L]低于健康对照组（P=0.001），亦低于未应用ATG预处理组（P=0.002），在移植后3月患者与健康对照组无差别。CD4+T细胞数在在移植后1个月四个亚组SD-nonGVHD、SD-GVHD、URD-nonGVHD、URD-GVHD患者均低于健康对照组，在移植后2月患者[(458.40±364.47)×106/L]低于健康对照组[(971.91±336.10)×106/L](P=0.000)，在移植后3月应用ATG预处理组[(300.73±224.75)×106/L，P=0.000]与未应用ATG预处理组[(537.70±221.88)×106/L，P=0.000]均低于健康对照组[(71.91±336.10)×106/L]，而两组间无差别(P=0.057)。CD8+T细胞数在移植后1月患者[(252.13±184.72)×106/L，P=0.004]低于健康对照组[(339.64±122.52)×106/L]，而在移植后2月[(763.30±576.59)×106/L，P=0.003]、3月[(633.45±397.71)×106/L，P=0.002]患者均高于健康对照组。Th17、Th1、Th2、Treg细胞数在移植后1月、2月、3月患者均低于健康对照组(P＜0.05)。(2) Th17细胞占CD4+T细胞的比例在移植后1月、2月、3月患者均低于健康对照组(P＜0.05)。Th1细胞比例在移植后1月、2月患者与健康对照组无差异，在移植后3月患者[(28.54±14.69)％，P=0.034]高于健康对照组[(20.74±10.26)％]。Th2细胞比例在移植后1月患者[(0.22±0.20)％，P=0.009]低于健康对照组[(0.50±0.57)％]，在移植后2月、3月患者与健康对照组无差异。Treg细胞比例在移植后1月、2月、3月患者与健康对照组均无差异。(3)转录因子RORγt、GATA3、FoxP3 mRNA表达量在移植后1月、2月、3月均低于健康对照组(P＜0.05)。T-bet mRNA表达量在移植后1月(0.3111±0.3513，P=0.000)、3月(0.4666±0.3960，P=0.045)患者均低于健康对照组(0.7279±0.5477)，移植后2月患者与健康对照组无差异。(4) IFN-γ浓度在移植后1月、2月、3月患者与健康对照组无差异。IL-6、IL-10浓度在移植后1月、2月、3月患者均高于健康对照组(P＜0.05)。TGF-β浓度在移植后1月、2月、3月患者均低于健康对照组(P＜0.05)。 3、动态监测CD4+T细胞亚群相关指标变化的结果(1) Th17细胞数在移植后1月[(2.49±2.16)×106/L]低于移植后3月[(3.95±2.91)×106/L](P=0.017)，1月与2月、2月与3月无差别。Th1细胞数在移植后1月[(78.88±88.89)×106/L]低于移植后3月[(139.52±84.08)×106/L](P=0.042)，1月与2月、2月与3月无差别。Th2、Treg细胞数在移植后1、2、3月之间比较均无差别。(2) Th17、Th1、Th2、Treg占CD4+T细胞的比例在移植后1、2、3月之间比较均无差别。(3) RORγt、T-bet、GATA3、FoxP3 mRNA表达量在移植后1、2、3月之间比较均无差别。(4) IFN-γ、 IL-10、TGF-β浓度在移植后1、2、3月之间比较均无差别。IL-6浓度在移植后1月[(4.17±4.80)pg/ml]低于移植后3月[(13.87±10.36)pg/ml](P=0.005)，移植后1月与2月、2月与3月比较无差别。 4、CD4+T细胞亚群与IFI的相关性(1)59例129次患者纳入本研究，其中12例(20.3％)患者发生IFI，其中确诊1例，病原菌为曲霉菌，拟诊11例。(2) Th17细胞数与IFI的发生相关（OR=0.176，P=0.005），而Th1、Th2、Treg细胞数与IFI的发生无关。(3) RORγt、T-bet、GATA3、FoxP3的mRNA表达量与IFI的发生无关。(4) IFN-γ、 IL-6、IL-10、TGF-β的浓度均与IFI的发生无关。 结论:1、allo-HSCT后CD4+T细胞及其各个亚群Th17、Th1、Th2、Treg均存在免疫重建延迟，而CD8+T细胞恢复较快。2、allo-HSCT后CD4+T细胞可能向Th17细胞的分化存在障碍。3、Th17细胞是allo-HSCT后IFI发生的保护因素。 第二部分异基因造血干细胞移植后肠道急性移植物抗宿主病危险因素分析 目的：探讨异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后肠道急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生的危险因素。 方法：回顾性总结2004年1月至2012年9月进行allo-HSCT的533例（534例次）患者临床资料，应用Logistic回归分析供受者人类白细胞抗原(HLA)配型是否相合、患者年龄、供者年龄、供受者性别关系、供受者亲缘关系、干细胞来源、预处理含或不含全身放射治疗(TBI)、HLA位点等因素与不同程度肠道aGVHD的关系。 结果：123例(23.0％)发生肠道aGVHD，其中1级86例(16.1％)，2～4级37例(6.9％)。多因素分析显示供受者HLA配型不合（OR=2.519，P=0.002）、供者年龄增大（OR=1.034，P=0.002）、女性供者男性受者（OR=1.840，P=0.008）是发生肠道aGVHD的危险因素，HLA-B38（OR=0.256，P=0.032）是其保护因素;供受者HLA配型不合（OR=2.799，P=0.011）、供者年龄增大（OR=1.045，P=0.012）、HLA-A1（OR=4.157，P=0.002）、A30（OR=3.143，P=0.005）是发生2～4级肠道aGVHD的危险因素。 结论：肠道aGVHD的发生及严重程度与供受者HLA配型是否相合、供者年龄、供受者性别关系及某些HLA位点相关。

目录

第一部分 异基因造血干细胞移植后CD4+T细胞免疫重建特征及与侵袭性真菌感染关系的研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

研究结论

参考文献

第二部分 异基因造血干细胞移植后肠道急性移植物抗宿主病危险因素分析

摘要

前言

病例和方法

结果

讨论

研究结论

参考文献

综述 造血干细胞移植后T细胞免疫重建研究中不同方法的应用

附录一 学位期间发表的文章

附录二 试剂与仪器

附录三 主要溶液的配制

附录四 缩略词表

致谢

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